病毒

腺相关病毒AAV

●什么是腺相关病毒

腺相关病毒英文全称是 Adeno-Associated Virus，简称AAV，AAV是一种小型无包膜病毒，属于细小病毒科。

AAV病毒的发现

1965年，研究人员在猿猴腺病毒15型制剂中发现了一种病毒污染物，这就是后来被称为AAV的腺相关病毒。从那时起，AAV已被成功开发成治疗载体，Glybera（alipogene tiparvovec）成为第一个被授权的基因治疗药物。

AAV外部呈现20面体结构，直径约26nm，其衣壳蛋白由VP1、VP2和VP3三种蛋白构成。AAV的基因组是一条单链线性DNA，约4700bp，包括上下游两个开放阅读框（ORF）：Rep和Cap，位于分别由145个核苷酸组成的2个T形反向末端重复序列（ITR）之间。ITR的作用是充当病毒复制起点和包装信号，Rep基因参与病毒复制和整合，编码病毒复制蛋白，Cap基因负责编码病毒三个衣壳蛋白。自然界中存在的天然野生型腺相关病毒，基因组上存在Rep和Cap基因，而实验用的AAV载体，是在野生腺相关病毒的基础上经过人工改造的质粒，基因组上没有Rep和Cap基因，因此也叫重组腺相关病毒（recombinant AAV，rAAV）。在没有特别指出的时候，简称AAV一般指已经改造过的AAV载体。

AVV有许多血清型。目前，已从人和猴体内分离出12种AAV血清型，不同AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构、组织特异性和序列，因而其识别与结合的细胞表面受体也有很大差别，这也导致不同血清型转染的组织类型、细胞类型和感染效率各不相同，在应用AAV病毒过程中需要根据不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒。

由于腺相关病毒具有宿主范围广、免疫原性低、表达稳定、物理性质稳定和安全性高等优点，已被广泛地应用于基础研究、临床试验、基因治疗中，腺相关病毒载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。

图1. AAV病毒和载体示意图（Hudry E et al,. 2019）

（A） 野生型腺相关病毒AAV的基因组结构，显示了AAV2基因编码的复制Rep、衣壳Cap和装配相关蛋白APP等产物，侧翼为反向末端重复序列（ITR）二级DNA发夹结构。

（B） 通过消除开放阅读框，仅保留侧翼ITR序列，并用相关的转基因替代，从野生型AAV2基因组产生基于重组AAV2的载体，最大序列长度组合为4.7 kb。这些基于AAV2的载体基因组（v.g.）通过反式共表达AAV基因产物Rep，Cap和AAP（以及来自辅助病毒如人腺病毒5型的必需基因产物）而包装在保护性衣壳中。任何基于AAV2的载体基因组都可以通过交叉包装，包装到各种不同类型的AAV变异衣壳（CapX）中，其中CapX基因与来自AAV2的Rep共表达。

（C） 自互补（sc）AAV的基因组结构在4.7 kb的相同总包装大小内具有相同转基因的两个互补拷贝，该拷贝由第三个ITR序列连接，该序列在病毒扩增过程中被修饰而不被解析（黑点）。

（D） AAV病毒粒子是一种多聚体蛋白，由20个小平面结构中的60个亚基组成，外径约为25 nm。根据二十面体对称性，所有亚基均以二聚体（红色），三聚体（蓝色）和五聚体（绿色）的形式对称整合在颗粒中。

●AAV腺相关病毒包装

AAV作为一种缺陷病毒，不能独立复制。它需要辅助病毒（如腺病毒和单纯疱疹病毒）的存在，才能在感染的宿主细胞中复制和合成组装蛋白，并产生子代AAV。如果没有辅助病毒，AAV会将其基因组整合到19号染色体上的一个特殊位点（AAVS1）中，并在整合后保持休眠状态，直到有辅助病毒将其从潜伏状态中拯救出来。

AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助性病毒的情况下产生重组腺相关病毒。该系统利用已鉴定的腺病毒基因产物来调节AAV的复制和表达，并通过转染将这些基因产物引入宿主细胞。目前，使用经典的三质粒共转染方法大量生产rAAV，即将外源基因载体质粒、含有rep和cap蛋白表达基因的腺病毒辅助质粒以及含有rep与cap蛋白表达基因的腺体相关病毒复制质粒一起转染HEK293细胞, 一段时间后，收集细胞裂解物, 并通过超速离心纯化以获得高滴度病毒。

作为应用最广泛的AAV，AAV2表现出对骨骼肌、神经元、血管平滑肌细胞和肝细胞的自然倾向。AAV2有三种细胞受体：硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）、AVβ5整合素和成纤维细胞生长因子受体1（FGFR-1）。HSPG作为主要受体，后两者具有共同受体活性，使AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞。值得注意的是，细胞外基质中大量的HSPG可以清除AAV颗粒，降低感染效率。

图2 rAAV转导通路（Wang D et al,. 2019）。

●AAV病毒包装的实验步骤

（1）获取目的基因；

（2）构建AAV载体质粒及测序：将目的基因克隆至AAV载体；

（3）载体质粒、辅助质粒和包装质粒共转染HEK293细胞；

（4）收集AAV粗病毒：离心分别收集细胞上清和细胞沉淀，反复冻融；

（5）AAV病毒浓缩纯化：PEG8000浓缩法/蔗糖密度梯度超速离心法；

（6）AAV质检：包括病毒滴度、质粒残留、宿主DNA残留、BSA残留、支原体检测、衣原体检测、内毒素检测、细菌及真菌检测等。

图3   AAV生产步骤。   （Bisgin A et al., 2021）。

●AAV病毒包装的优点缺点

AAV优点：

1、免疫原性低：AAV2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小，AAV感染组织后很少会被免疫系统清除；

2、宿主范围广：可以感染广泛的哺乳动物并且成功应用于人类和非人类蛋白的表达，不仅可转染分裂细胞，也可转染非分裂细胞；

3、表达稳定、持续时间长：不整合到宿主基因组，可长期稳定表达外源基因，在宿主细胞中形成附加体（episome）存在于细胞核中，体内可持续表达6个月以上；

4、多种血清型：AAV1~AAV9以及DJ、DJ/8、Rh10等12种血清型，不同血清型的AAV可以靶向不同的细胞和组织；

5、扩散性强：与慢病毒和腺病毒相比，AAV可以穿透血脑屏障，是最适合用来感染神经元和胶质细胞的。

6、安全性高：迄今从未发现野生型AAV对人体致病，重组AAV是三质粒系统，基因组序列上去除了大部分的野生型AAV基因组元件，只有ITR序列，其他各个基因由独立的质粒表达，进一步保证了安全性；

AAV缺点：

1、载体容量小：可插入序列比慢病毒要小很多，目前最多只能容纳不超过3kb的外源DNA片段；

2、表达速度慢：相比较慢病毒和腺病毒而言，rAAV在感染后需要较长的时间来表达外源基因，一般在感染两周后才表达，因为需要从单链DNA变成双链DNA。

3、体外实验表达水平较低：主要是因为rAAV病毒的基因组是单链DNA，在体外环境形成双链并转录翻译外源基因的效率非常低。可以在体外水平感染rAAV病毒的同时感染辅助病毒比如Ad5型腺病毒或者终浓度10~50mM的丁酸钠等方法提高细胞实验的rAAV表达量.

●AAV包装实验中的常见问题

1、AAV作为一种体内常用的工具载体，可应用于哪些方面？

（1）基因过表达。将目的基因的CDS区构建到AAV载体，注射到动物体内实现过表达；

（2）基因干扰表达。将针对目的基因设计的shRNA构建到AAV载体，注射到动物体内实现干扰表达；

（3）目的基因敲除。将针对目的基因设计的sgRNA和Cas9编码序列分别构建到AAV载体中，注射到动物体内实现基因敲除；

（4）内源过表达。将针对目的基因设计的sgRNA和dCas9分别构建到AAV载体，实现内源过表达。

2、为什么很少用AAV做细胞感染，而更适合做动物实验？

由于AAV转染细胞的表达效率较低，在没有冠状病毒或辅因子的情况下，单链DNA转化为双链DNA的过程非常缓慢；此外，细胞在体外的生长速度很快，细胞中感染的AAV会随着细胞分裂而不断稀释，进一步导致其表达水平降低。然而，在体内研究中，不同血清型的AAV可用于特异性靶向多种不同类型的器官和组织，如神经系统、眼睛、肌肉和肝脏，并且转导途径简单。纯化和浓缩的病毒可以在多个点直接注射到靶器官中。注射的组织细胞通常增殖不快，其免疫原性也低于腺病毒，感染效率高于慢病毒，携带的外源基因表达因子更丰富，因此表达丰度和持续时间更好。

因为AAV转染细胞的表达效率低，在没有辅助病毒或辅助因子的情况下，单链DNA变成双链DNA的过程十分缓慢；另外，体外细胞生长速度快，细胞中感染的AAV会随着细胞分裂不断稀释，进一步导致其表达水平降低。但在体内研究中，可以利用不同血清型的AAV，特异性靶向神经系统、眼睛、肌肉和肝脏等多种不同类型的器官组织，且转导途径简便，可以将纯化浓缩好的病毒直接多点注射靶器官，注射的组织细胞通常增殖不会很快，其免疫原性也低于腺病毒，感染效率高于慢病毒，所携带的外源基因表达的因子较为丰富，因此表达丰度和持续的时间更好。

3、AAV腺相关病毒的表达效果能维持多久？

AAV在细胞内主要是以环状的dsDNA附加体（Circularised dsDNA episomes）的形式存在，而不会像慢病毒那样整合到宿主细胞的基因组。对于分裂不旺盛的细胞，如神经元，AAV可持续表达1年以上甚至2年，对于分裂较旺盛的细胞，一般也可维持3~6个月或以上。

4、AAV病毒会对人体造成损伤吗?

AAV腺相关病毒是一种较为常见的病毒，在自然界中广泛存在于人类、猴子、老鼠等哺乳动物体内，以及大量的无脊椎动物和鸟类体内。AAV病毒是一种单链DNA病毒，不具有明显的致病性，不会引发重大疾病，但是可以在人体细胞中进行基因转导。AAV病毒具有良好的安全性和转导效率，可以在不影响正常生理功能的情况下传递特定的基因负载，被广泛应用于基因治疗的研究和实际应用中。

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