恒温扩增与核酸检测

RT-LAMP恒温扩增

逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是公认的金标准技术。然而，它需要复杂的设备、实验室环境和专业人员来进行测试。这些阻碍了快速和大规模的检测，尤其是在资源不足的地区。因此，研究人员正在研究替代性和负担得起的护理点（POCT）检测方法，这些方法可以高灵敏度诊断新冠肺炎或其他传染病。

等温核酸扩增技术非常具有吸引力，因为它不需要热循环仪，因此它比RT-PCR更便宜，灵敏度相当。目前，研究人员已经开发了几种快速的等温扩增技术用于病原体检测：

1. 环状滚动扩增(rolling circle amplification)技术，

2. 重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification (RPA)），

3. 链置换扩增strand-displacement amplification (SDA)，

4. 梯型熔解温度核酸等温扩增技术 ladder-shape melting temperature isothermal amplification (LMTIA)

5. 逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）。

RT-LAMP扩增使用四到六个引物来靶向和扩增特定的基因区域。该扩增反应在单管中等温进行，不需要庞大的仪器。它提供了简单的检测技术，比金标准更便宜、更快。

许多研究人员证明了RT-LAMP在COVID-19诊断中的效率。然而，由于受到引物的数量的影响，RT-LAMP技术最常见的限制是由不需要的二级结构引起的错误扩增。即使有仔细的引物设计和检查二聚体和发夹结构的程序的可用性，也不能保证这些结构不会实际形成。特别是，目前的方案建议反应时间不得超过30分钟，以避免产生误导性结果。这使得检测低拷贝数的样品具有挑战性，并降低了RT-LAMP技术的效率。

为了解决这个问题，我们猜测较少数量的LAMP引物将降低假阳性率，这是LAMP技术最常见的局限性。通常，通过增加酶的浓度或添加引物结合增强子（如盐酸胍GuHCl）来优化开发的比色和荧光测定的性能，可以提高扩增速率。在这项实验中，我们通过将五种引物与针对不同病毒基因（如RdRP，S和N）的五种引物组进行比较，证明了使用五种引物可以减少错误扩增的效率。使用五种引物（E-ID1）的优化方案消除了错误扩增，从而提高了检测的灵敏度和有效性。

RT-LAMP引物性能

研究人员在阳性对照（PC）和非模板对照（NTC）上测试了针对N，E，S或RdRp等不同基因的六组引物的性能。在比色鉴定中，在反应前（0分钟）观察所有试管中的颜色，然后每10分钟观察一次。根据图1所示的结果，引物组N-ID15n1L和RdRp-ID37在40分钟时阳性反应中显示出红色到黄色的色差。引物组E-ID1在50分钟时开始产生颜色变化（未经优化），而大多数引物组开始显示错误扩增，因为NTC管中的颜色变为黄色。由于除E-ID1外的所有引物组中NTC均出现假阳性，因此反应在60分钟后被终止。

图1. 在阳性对照（PC）和非模板对照（NTC）上使用所有引物组进行比色试验。

在比色鉴定中，PC管中出现从红色到黄色的可见颜色变化，阴性保持红色。在反应前（0分钟）和反应后（30至60分钟）观察到颜色变化。绿色圆圈表示PC反应管中最早的颜色发展。红圈代表NTC的反应导致的最早的错误扩增。

根据引物组的不同，假阳性结果的出现时间不同。由于在N-ID15和S-ID17的NTC管中在大约40分钟出现扩增错误，因此不建议将反应孵育超过40分钟。但是，将时间延长120分钟不会导致只有五个引物的E-ID1组出现扩增错误。因此，我们选择E-ID1引物组进行进一步测试。

比色和荧光RT-LAMP扩增分析的优化

我们开发并优化了比色和荧光RT-LAMP测定法，以增强E基因引物的性能。

优化方法包括：

（1）添加盐酸胍（GuHCl），

（2）测试不同的DNA聚合酶（Bst 2.0与Bst 3.0版本），

（3）调整最佳反应温度。

与优化前的检测时间相比(~ 50分钟），比色测定显示30分钟内颜色变化较早（图2a）。此外，在荧光RT-LAMP测定中观察到这种改善，其中它平均约27分钟检测到阳性样品（P1，P13，P14和PC），而优化前平均检测时间为32分钟（图2b，c）。在此运行中，样品J31的检测时间没有改善，但是，一些实验表明，当使用不同的酶浓度时，未检测到J31。

图2. 优化后的RT-LAMP反应效果

（a） 优化前后在临床样品上使用E-ID1引物组的比色RT-LAMP。与优化前的50分钟相比，优化的比色测定在30分钟内开始检测出阳性样品。

（b） 荧光定量RT-LAMP之前（x轴上的循环数也对应于反应时间，以分钟为单位，因为这里建立的反应是60个1分钟的循环）

（c）在不同临床样品上使用LavalLAMP试剂优化之后，检测时间的改善是明显的。

Bst DNA聚合酶的选择

与Bst 2.0 DNA聚合酶相比，Bst 3.0 DNA聚合酶具有更高的扩增性能和逆转录酶活性，可以单酶RT-LAMP反应。通过在荧光定量RT-LAMP中与Bst 2.0 DNA聚合酶进行比较，选择与E-ID1引物组表现出最佳性能的酶进行进一步分析。将两种酶以相同的浓度添加到PC和NTC上，一式三份。使用Bst 2.0 DNA聚合酶，PC在17分钟左右出现阳性扩增，而使用Bst 3.0 DNA聚合酶，PC在21分钟后扩增。这一结果表明Bst 2.0 DNA聚合酶比Bst 3.0 DNA聚合酶表现得更快。本实验用的是NEB的Bst酶，Magigen Bst DNA聚合酶也有很好的表现。

研究人员测试了GuHCl在比色和荧光RT-LAMP反应中对E-ID1引物组性能的影响，因为据报道它可以提高检测速度和效率。图3a显示了在阳性临床标本PC和NTC上添加和不添加GuHCl（40mM）的两组比色RT-LAMP。在24-27分钟后，阳性样品中的颜色开始显现。在与GuHCl的反应中，样品J49在27分钟后开始显示颜色变化，而黄色在30分钟后完全显现。另一方面，在不添加GuHCl的情况下，该样品的颜色在35分钟后开始变化，在40分钟后完全呈现。GuHCl的作用也在PC和NTC三组样品上进行了荧光测定（图3b）。在没有GuHCl的情况下，PC反应的平均检测时间为29分钟，而在加入GuHCl的条件下为约22.5分钟，检测时间有22%的改进。120分钟后，两项测试均未出现明显的误扩增。

图3. GuHCl对RT-LAMP反应的影响

（a）测试在比色RT-LAMP反应中添加40 mM盐酸胍（GuHCl）对阳性临床样品（P13，P14，J10，J49）和不确定样品（J43）的影响。添加GuHCl的样品（J49）改善了检测时间，与没有GuHCl的反应相比，它在8分钟前开始变色。然而，不确定性样本J43在两者中均为阴性。红色虚线矩形突出显示了在相同反应时间加入GuHCl后颜色较早变为黄色的样品。

（b） 有和没有GuHCl的荧光RT-LAMP PC和NTC一式三份测试。所有带有GuHCl的PC都比没有GuHCl的PC早扩增。在比色和荧光测试中，NTC均未扩增，这表明GuHCl可提高检测速度，而不会引起NTC的错误扩增。

E基因引物的检测限LoD

将SARS-CoV-2型病毒合成RNA对照（Twist synthetic RNA对照51）连续稀释（10¹，10²，10³，10⁴，10⁵和10⁶倍），以确定RT-LAMP反应的检测限（LoD）。图4a显示了靶向E基因的比色RT-LAMP测定的LoD。在稀释1、10¹、10²和10³倍的RNA中，转黄色的显色显著，对应于500个拷贝/反应体积（25µL）或10³倍稀释的20个拷贝/µL。反应后，将每种稀释液的反应混合物加载在2%琼脂糖中，并在UV反式照明器下观察，以进一步检查带型强度是否随着病毒载量的减少而降低（图4b）。结果表明，在检测到的稀释液中出现梯型条带模式，而在其他稀释液中没有出现条带。琼脂糖凝胶电泳和比色鉴定结果一致。

图4. 在连续稀释的COVID-19病毒合成RNA对照的比色RT-LAMP测定中测试的E基因引物的检测限（LoD）

（a）该测试检测到多达10³倍稀释液，相当于500拷贝/反应体积（25µL）或20拷贝/µL。

（b） 通过在2%琼脂糖凝胶中加载反应后的RT-LAMP产物来验证比色LoD结果，显示检测到的稀释样品的带型。

临床样品的RT-LAMP测试

研究人员对E-ID1引物组的性能在临床标本上进行了色度和荧光测试。然后使用琼脂糖凝胶电泳验证这些结果。在比色RT-LAMP反应中，将试管在设定为65°C的热块中孵育。阳性临床标本在20分钟后开始显示颜色变化，而阳性和阴性之间的色差在30分钟后最明显。最终，比色RT-LAMP和RT-PCR结果之间的一致性为94.5%。

类似地，使用优化的RT-LAMP方案对临床样本进行荧光测定。将反应物置于70°C的热循环仪中75分钟。该荧光测定与RT-PCR结果的一致性为96.7%。

RT-LAMP测定的敏感性和特异性

在比色RT-LAMP测定中，共检测了165个临床样本（根据RT-PCR结果，57个是阳性样本，108个是阴性样本）。对比RT-PCR，57个样本中有51个RT-LAMP检出为阳性，108个样本中105个RT-LAMP检测为阴性，其中3个为假阳性，6个为假阴性。因此，比色RT-LAMP测定的灵敏度为89.5%，特异性为97.2%，准确度为94.5%。RT-PCR的阳性百分比值（PPV）计算为94.4%，而阴性百分比值（NPV）为94.6%。在荧光检测中，检测了150份临床标本，其中51份为RT-PCR阳性，99份为RT-PCR阴性。51个阳性结果中的47个和99个阴性结果中的98个与RT-PCR一致，其中有1个假阳性结果和4个假阴性结果。荧光测定法的灵敏度为92.2%，特异性为99%，准确率为96.7%。荧光定量RT-LAMP测定的PPV为98%，NPV为96.1%。

通过测量434和560nm波长下的吸光度，使用分光光度计在反应后定量阳性和阴性样品中的显色。图6a显示，正黄色和负红色样品之间的光密度（ΔOD）差异具有统计学意义（p < 0.0001、95%置信区间）。在测试的样本中，具有高病毒载量的样本在 ~ 20分钟检测到，而病毒载量低的病毒要多达75分钟才检测到（图6b，c）。平均而言，检测时间计算为37分钟。此外，90%的COVID-19病毒阳性样本在50分钟内被检测到（图6c）。所有高、中、低病毒载量样本均包含在诊断可靠性计算中。

图6. RT-LAMP检测所需时间

（a）   通过分光光度法测量434和560 nm （n = 10) 处的光密度（ΔOD）来量化阳性和阴性样品之间的颜色变化。方框内的线表示中间值，上下延伸线表示最大值和最小值。四个星号（*）对应于p < 0.0001，这是一个具有统计学意义的差异（未配对t检验，p < 0.05、95%置信区间）。

（b） 所有阳性样本的检测阈值的时间。虚线表示中间检测时间（33分钟）。

（c） 检测到的阳性样本总数的百分比随时间变化图。所有样本（100%）在75分钟内被检测到。此外，90%的阳性样本在50分钟内被诊断出来。

此外，研究人员将五种SARS-CoV-2变异株与其他严重急性呼吸综合征病毒进行比对，在计算机上测试了E-ID1引物组的包容性。引物与所有变体中的保守区结合，但在其他SARS中并不常见。此外，在体外测试了E-ID1引物对最常见的呼吸道病毒的交叉反应性，包括副流感病毒3、肠道病毒、鼻病毒、人偏肺病毒A + B、 副流感病毒4、博卡病毒和冠状病毒229 E。比色测定仅检测到SARS-CoV-2，但未检测到其他呼吸道病毒，这表明对诊断COVID-19感染具有高度特异性。

使用五个引物可以延迟或防止所有引物组中的误扩增（假阳性）

在PC和NTC样品上测试所有引物组，以确认“五个引物”在防止假阳性结果方面的优势。图7比较了E-ID1组（优化后）和其他先前测试的引物组（N-ID15、N-ID15n1L、S-ID17、S-ID24和RdRp-ID37）的性能，这些引物组是用五个引物而不是六个引物制备的，没有LF引物。与使用六个引物的初始性能相比，N-ID15、N-ID15n1L、S-ID17和S-ID24组的延迟误扩增是明显的。此外，在120分钟内观察并记录颜色变化。在所有引物组中使用五个引物可以耐受更长的反应时间而不会出现错误扩增。此外，E-ID1和RdRP-ID37的引物组即使在120分钟后也没有显示出误扩增。总体而言，使用五个引物而不是六个引物明显延缓了误扩增的发生。然而，除E-ID1和RdRP-ID37外，所有其他引物组仍导致NTC管中的错误扩增。该结果验证了E-ID1引物组在荧光和比色RT-LAMP测定中的显著性能。

图7. 5个引物与6个引物的结果对比

使用所有引物组进行比色试验，每个引物组包含奥密克戎阳性对照（PC）和非模板对照（NTC）上的五个引物（F3、B3、FIP、BIP和LB）。与使用具有六个引物的相同引物组相比，所有引物组在产生错误扩增之前对较长反应时间显示出更高的耐受性。然而，N-ID15、N-ID15n1L、S-ID17和S-ID24引物组（不含LF引物）在90和120分钟之间仍在NTC中产生错误扩增。相反，使用E-ID1和RdRp-ID37引物甚至在120分钟内也无明显假阳性扩增。

结论

本研究旨在改善RT-LAMP技术的限制因素之一，即导致假阳性结果的非特异性扩增。一般来说，假阳性结果发生在30分钟内，因此，目前的方案不建议超过30分钟的反应时间。这导致诊断特别低的病毒载量样本的困难。为了消除这些错误，我们设计了一套引物，即E-ID1，由五个引物组成，其中不包括前向环（LF）引物。结果表明，五引物设计提供了稳定的引物靶向性，并避免了120分钟的误配。优化的比色和荧光RT-LAMP测定减少了检测时间。比色技术只使用加热块，没有任何体积庞大或昂贵的仪器。测试结果可以通过简单的颜色变化直观地解释。本研究中使用的引物靶向SARS-CoV-2型E基因中的保守区，而不考虑变体。比色法和荧光法都表现出色，灵敏度分别为89.5%和92.2%，成功取代了金标准RT-PCR。未来的工作将包括通过进一步优化或使用自制试剂来提高测定的准确性和成本。此外，目前已经商业化的Magigen RT-LAMP Kit试剂套件, 是冷冻干燥试剂，灵敏度与PCR检测相当，可以在大规模检测产品中使用，减少了开发成本，大幅提高了检测效率，适用于各类POC检测产品开发。

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