基因治疗

CRISPR/Cas递送系统: AAV / AdV / LV载体

癌症是世界上最致命的疾病之一，目前仍然难以有效治疗。已经开发了各种治疗方法，包括小分子和基因疗法。

CRISPR/Cas9基因编辑方法为临床应用提供了一种可行的策略。

CRISPR–Cas9靶向DNA片段可以作为一种手段来精确定位癌症特异性序列的变化。此外，近年来，嵌合抗原受体（CAR）的开发在癌症治疗中具有里程碑意义。尽管CAR T细胞疗法已经显示出一些令人鼓舞的结果，但仍有一些局限性需要解决，CRISPR/Cas系统已显示出改善基于CAR T细胞的癌症免疫疗法的前景。

此外，在基因治疗中，致癌病毒多年来一直是一个重要的问题，CRISPR为防止它们导致癌症提供了一种解决方案。CRISPR-Cas系统可以使用各种递送策略，如病毒载体、细胞外囊泡（EV）、物理方法和纳米复合物，将CRISPR/Cas输送到哺乳动物细胞中。

有哪些方法用于CRISPR-Cas9递送？

CRISPR-Cas系统可以使用多种策略，例如病毒载体和细胞外囊泡EV，递送到哺乳动物细胞中。除此之外，还有其他方法，如物理方法和纳米复合物等。

用于CRISPR-Cas9递送的病毒载体和细胞外囊泡EV

病毒载体

病毒是进行基因传递的可信赖载体。重组和假型病毒载体使哺乳动物基因治疗成为可能。目前，用于CRISPR/Cas递送的最常用的病毒载体主要有：

1、腺相关病毒（AAV）

2、腺病毒载体（AdV）

3、慢病毒载体（LV）

这些载体已经在临床试验中使用。图1显示了这三种载体的结构。

腺相关病毒载体AAV(图1A)

AAV是单链DNA病毒，没有包膜，体积小，对人类没有致病性。被去除的腺病毒载体是双链DNA病毒，尽管仍然能够转导广谱的分裂和非分裂细胞，但没有来自其野生型的大多数基因，携带高达35 kb的遗传货物。主要来源于HIV-1的慢病毒载体能够将其转基因（〜9 kb）整合到人类基因组中，并且适合长期基因表达。

图1. 常用的基因递送工具AAV、AdV、LV载体结构                                   Seyed Esmaeil Ahmadi

AAV是对人类不致病的小型无包膜单链DNA病毒。这些细小病毒科的成员作为基因传递系统引起了研究人员的注意。尽管大约80%的普通人群对这些病毒呈血清阳性，但尚未报道AAV与人类疾病之间的联系。AAV的各种特征，包括相对较低的免疫原性，细胞毒性和染色体整合概率，使其成为CRISPR/Cas的典型递送系统，特别是在体内。此外，不同类型的AAV可用于将基因递送到多种细胞中，例如肺，心脏，神经元和肌肉细胞，从而使其成为用于组织特异性应用的优异向性载体。

用于递送CRISPR/Cas系统的两种病毒载体的作用机制(图2)：

1、整合载体（慢病毒载体）

2、非整合载体（腺病毒AdV和腺相关病毒AAV载体）

在某种程度上，AAV仍然具有将其基因整合到宿主基因组中的能力，为了克服这一限制，研究人员开发了重组AAV。AAV的Rep基因负责产生Rep蛋白（Rep78，Rep68，Rep52，Rep40），参与病毒基因组的包装，复制，基因表达和遗传物质的整合。为了准确的位点特异性整合，AAV需要Rep蛋白，特别是Rep78和68，尽管在重组形式的AAV中，Rep基因已被去除。

总体而言，这些重组AAV已被证明是有效的基因传递系统；例如，将CRISPR/Cas9递送至携带低密度脂蛋白受体（LDLR）基因突变的小鼠表现出治疗效果。

到目前为止，许多基于AAV的基因疗法已获得FDA的批准，例如在庞贝病和遗传性视网膜疾病（IRD）视网膜色素上皮（RPE）65-LCA（LCA2）中，这表明AAV载体的有效性。

此外，AAV有效递送CRISPR/Cas9系统为疾病建模铺平了道路，例如神经退行性异常，肌肉营养不良，肝病和镰状细胞病等。

虽然AAV有着令人印象深刻的成就记录，但它们有限的包装能力和基因组长度限制了它们携带超过5kb的基因有效载荷 。在这种情况下，携带SpCas9蛋白等大型载物仍然受到相当大的限制。科学家们设计了许多方法来绕过AAV的包装能力限制。其中之一是用仅携带sgRNA的AAV转导细胞，这些细胞已经被诱导表达Cas9蛋白。另一种策略是使用两种标记独特的AAV共转导细胞，一种携带sgRNA，另一种携带Cas9蛋白。然而，人们对这种方法感到担忧，因为它需要高病毒剂量和准确追踪载体以确认共转导。

图2. 两种类型的病毒载体递送CRISPR/Cas系统的作用机制：整合型载体（慢病毒载体）和非整合型载体（腺病毒和腺相关病毒AAV载体）

有一些基因甚至比双AVV载体的容量（9 kb）还要大；例如，CDH23（Usher综合征基因, 约为10 kb）和DMD（肌肉萎缩症基因, 约为11.1 kb）。为了将这些基因传递到宿主细胞中，科学家设计了一种三重AAV系统。

有一种称为CRISPR/Cas介导的碱基和引物编辑新方法使用dead或Cas9切口酶（nCas9）酶，它可以修饰CRISPR-Cas系统，从而可以使用单载体递送，并克服病毒载体包装能力限制的挑战。该系统的特征还包括不诱导DSB，不需要DNA供体模板，并且具有编辑非分裂细胞的强大能力。AAV已被证明有能力递送CRISPR DNA碱基编辑工具；例如，一项研究报道，通过双AAV体内递送基于CRISPR/Cas的胞苷碱基编辑器，可以治疗动物模型中的肌萎缩侧索硬化症（ALS）。已经有证据表明，利用AAV递送的prime editor是纠正成年小鼠致病性等位基因和癌症建模的有效工具，因为它比基于CRISPR/Cas的base editor具有显着更低的脱靶效应。尽管AAV-base和prime编辑系统改善了与AAV介导的CRISPR/Cas9递送相关的一些缺点，但在一定程度上仍然存在局限性，包括病毒诱导的免疫应答，载体持久性和脱靶活性。

AAV的包装容量限制可以通过利用其他类别的Cas蛋白（如CRISPR Cas12a）或具有较小尺寸的不同形式的CRISPR Cas9（如SaCas9和St1-Cas9）来处理。此外，将大型转基因分成两个单独的部分，并将每一半包装成两组AAV，也可以扩展AAV的输送能力。这种方法是通过称为内含子介导的反式剪接的过程进行的，该过程在某种程度上类似于mRNA剪接。这种方法已被用于交付碱基和碱基编辑系统。

体内递送的另一个具有挑战性的问题是针对细菌Cas9蛋白和AAV衣壳的故有的免疫原性。可以通过改变AAV衣壳的抗原、产生嵌合AAV衣壳以降低抗体应答并逃避免疫系统来改善AAV衣壳。

AAV的特征包括低免疫原性和细胞毒性，以及染色体整合的可能性很小，使其成为CRISPR/Cas系统的理想输送管道。除此之外，与其他病毒载体相比，具有多种类型和多样化的递送方法，如双重和三重AAV载体，弥补了它们的局限性，并使它们成为基因递送的首选。

腺病毒载体AdV(图1B)

腺病毒AdV是一种双链DNA病毒，可以转导广谱的分裂细胞和非分裂细胞。这些载体可以携带多达37 kb遗传物，转导后，它们会在宿主DNA附近产生附加体DNA，而不是整合到基因组中。值得注意的是，AdV的附加基因表达消除了脱靶效应，这是基于CRISPR/Cas的基因编辑的局限性。

目前已经有了几代AdV产品：

第一代，E1基因被删除，使用这一代产品可以引起急性和慢性免疫反应。

第二代，AdV的E2和E4基因被去除，以减少免疫应答。值得注意的是，第二代AdV的容量（〜14 kb）大于第一代（〜8 kb），掺入转基因的效果明显优于第一代。

第三代腺病毒载体: 即所谓空壳载体(gutless or gutted adenovirus vectors)或辅助依赖性载体(hdAd, helper-dependent adenovirus vector)

允许克隆多达35kb的病毒基因；因此，它们打破了输送CRISPR/Cas9系统的尺寸限制。值得一提的是，与第二代ADV一样，这一代不会引发慢性免疫反应。

重组AdV5已经显示出在小鼠体内实现CRISPR/Cas9介导的人α-1-抗胰蛋白酶基因敲入的潜力，并且已经证明基因表达持续超过200天。

尽管有报道说AdV会刺激免疫系统对抗载体和Cas蛋白，在最近的一项研究中，AdV将CRISPR/Cas12a递送至人肝细胞，证明其对人类细胞基因编辑的潜力。

此外，AdV结构蛋白（Hexon，penton和fiber）具有很强的可操作性，这有利于产生具有组织特异性取向的AdV。再加上这些特性以及ADV对临床试验安全的事实，可以大规模生产，并且具有成本效益，使其成为CRISPR/Cas递送必不可少的工具。

这些有益的特征可以通过以下事实得到证实：AdV成为2019年冠状病毒病（COVID-19）mRNA疫苗的首选。这预示着AdV系统可能成为全球性的应用。

总之，在基于CRISPR/Cas的基因编辑系统中，AdV的附加型基因表达消除了脱靶效应。此外，其巨大的包装容量允许装载大型基因有效载荷，这是其他病毒载体所无法比拟的。

慢病毒载体Lentiviral vector，LV, 图1C

HIV-1衍生的慢病毒载体LV是单链RNA（ssRNA）病毒，主要用于将所需转基因整合到分裂和非分裂细胞中（图2）。他们的输送基因物质的能力约为9 kb，被富含脂质的衣壳包围。LV有四代，其中第三代和第四代在临床应用方面大多是安全的。

基于CRISPR/Cas的基因编辑的有效性在很大程度上取决于其成分向宿主细胞的递送。由于LV是一种很好的基因递送工具，并且CRISPR/Cas系统已被证明在人类细胞中有效，因此LV被选择来表达整个系统。与shRNA一样，携带CRISPR/Cas9系统的LV最初也是在具有大量sgRNA的文库模型中设计的。

一项研究表明，靶向18000多个人类基因的基于LV的基因组级CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文库对于阴性和阳性选择筛选非常有价值，这些筛选通常用于体外测定，以确定细胞中的干扰，尤其是受各种刺激影响的癌症细胞。特别的是，该文库已被用于指定对癌症细胞和多能干细胞的生存能力至关重要的基因。它还可以筛选导致黑色素瘤细胞对vemurafenib产生耐药性的基因的功能丧失。目前，还开发了基于LV的CRISPR/Cas文库，该文库已鉴定出与髓系白血病（Nf1、Ezh2、Dnmt3a、Tet2和Runx1）和胎儿血红蛋白再诱导（BCL11A）有关的新型肿瘤抑制基因。

目前，用LV递送的CRISPR/Cas9应用正在扩展到HIV-1和HBV感染的靶向治疗领域，以及遗传缺陷疾病的治疗领域，如囊性纤维化和神经退行性疾病。

此外，其他方法，包括碱基和引物编辑CRISPR系统以及表观遗传学修饰物，也已与LV配对。由于LV将编码CRISPR/Cas转基因整合到宿主基因组中，并且由于其持久的基因表达，脱靶效应的可能性可能会引起关注。为了解决这一风险，研究人员开发了整合缺陷慢病毒载体（IDLV），以提供短暂的CRISPR/Cas表达。

在不可切除的肝细胞癌中，HIF-1α的表达会恶化疾病的预后，阻碍患者的整体改善。最近的一项研究使用LV递送的CRISPR/Cas9系统在小鼠体内敲除了HIF-1α，在注射后三天，该系统显著降低了肿瘤组织中HIF-1α的表达，显示出有价值的抗肿瘤作用。产生融合癌基因的染色体易位在某些癌症中很常见，是重要的肿瘤发生因素。例如，BCR-ABL重排产生的酪氨酸激酶可发展为慢性粒细胞白血病（CML）。酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如伊马替尼，可以显著抑制BCR-ABL的产物，尽管有报道称这些TKIs具有耐药性。

因此，Martinez Lage及其同事使用基于LV的CRISPR/Cas9系统诱导BCR-ABL重排基因内含子的缺失，这导致BCR反式激活结构域的显著缺失以及ABL的DNA结合结构域的移码突变。

LV一直是一种有趣的病毒载体，用于传递基因，特别是用于临床目的。这是因为转基因可以整合到宿主基因组中，并长时间表达。此外，所需的基因可以在细胞分裂后传递给新细胞，从而确保CRISPR/Cas功能在未来很长一段时间内表达。

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