图2所示是我构建的CRISPR-Cas9基因组编辑系统，这个系统也是一个双质粒系统，为了方便描述，我把这两个质粒分别称为Plasmid#1和Plasmid#2。用双质粒系统的好处是可以把固定不动的组件放在其中一个质粒上(比如这里的Plasmid#1)，把每次编辑都需要变动的组件放到另一个质粒上(比如这里的Plasmid#2)，这样的话，每次编辑时只需要构建一个小的质粒就可以了。在我的系统里，Plasmid#1用来搭载固定不动的组件——Cas9蛋白表达元件和重组酶表达元件，Plasmid#2用来搭载sgRNA表达元件。在质粒消除系统上，我也做了一点改进，我在Plasmid#2上使用低拷贝温敏型复制子pSC101，每一轮编辑之后，只要将阳性克隆放在37℃中培养就可以很快除去这个质粒，再引入新的Plasmid#2进来，进行新一轮编辑；我在Plasmid#1上放了一个sacB基因，含有这个基因的细胞对蔗糖敏感，所以每次最后一轮编辑完成之后，只要将阳性克隆在无抗条件下培养一段时间，再将菌液稀释涂布在含有蔗糖的平板上，长出来的菌落就已经丢失了Plasmid#1。

于是，我又对系统进行了一些改进，得到了CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版2，如图3所示。我把Donor DNA插入到Plasmid#2上.

这样做有三个好处：

(1) 转化Plasmid#2比共转Plasmid#2和线性Donor DNA效率更高；

(2) Donor DNA在质粒上不会受到核酸外切酶的攻击；

(3) Donor DNA还可以随着质粒一起复制，增加自己的拷贝数。

这样一来，编辑效率就显著提高了。将Donor DNA插入到Plasmid#2上本质上也改变了同源重组的方式，不再是线性Donor DNA与环状基因组(未被切割)或线性基因组(被切割)之间发生重组，而是环状Donor DNA与线性基因组(被切割)之间发生重组。重组要发生，基因组和Donor DNA之间必须有一方是线性的，环状基因组与环状Donor DNA之间发生重组的概率极低。

前面的基因组编辑系统为什么需要高转化效率呢？我用一个简单的模型来描述下：假设一管感受态细胞有a个细胞，转化之后有1/b个细胞获得了Plasmid#2，而这些细胞当中有1/c被成功编辑，被成功编辑的细胞中有1/d形成菌落，那么最后能得到的阳性菌落数为N=a*1/b*1/c*1/d。实际上，一管感受态细胞的数目大概就是109，1/b能达到1/100算不错，1/c能达到1/1000算不错，1/d能达到1/10算不错，所以最多也只能得到100-1000个阳性菌落。经验不够的操作者很难做到这样的结果。如果现在我在公式里加一个变量，变成N=a*1/b*2n*1/c*1/d (n可以是任意正整数)，那会怎么样，是不是瞬间觉得1/b、1/c、1/d都不重要了，数值再小也没事。为了做到这一点或部分做到这一点，我把控制Cas9蛋白和sgRNA表达的启动子都换成了严谨性强的诱导型启动子PBAD。在将Plasmid#2转化之后，Cas9蛋白和sgRNA不会表达，这时只要有一个细胞获得了Plasmid#2，就可以通过细胞复制得到无数个含有Plasmid#2的细胞。当细胞数足够多之后再诱导Cas9、sgRNA和重组酶表达，从而启动基因编辑反应，这样可以将编辑效率提高100倍以上。

为了解决这个矛盾，我又想到了一个办法，就是把Donor DNA在基因编辑启动时从Plasmid#2上释放出来，以线性的形式参与重组。要达到这个效果，只需要在Donor DNA两侧加上基因组上的靶位点，如图6所示。这样一来，Cas9蛋白在切割基因组的同时，也会切割Plasmid#2并释放Donor DNA。由于基因组只有一个拷贝，而Plasmid#2有大约5个拷贝，因此只要控制好Cas9蛋白的诱导强度，就可以让基因组被切割，而Plasmid#2部分拷贝被切割，因此可以维持Plasmid#2的存在。

按照这个策略，我测试的结果符合预期，Plasmid#2被整合到基因组上的情况不再发生了，平板上得到的菌落基本都是阳性的。大家可能发现了，图6中有两种Plasmid#2，一种只有一个sgRNA表达元件，一种有两个sgRNA表达元件。对于基因敲除、基因插入、基因替换、DNA大片段插入，只需要在基因组上切一刀就可以了，因此只需要表达一种sgRNA；而对于基因组大片段删除，则需要在基因组上切两刀，分别在要删除的大片段两端切割，这种情况就需要表达两种sgRNA。