CRISPR基因治疗技术

CRISPR递送系统

CRISPR技术是靶向血细胞的理想方法，目前最新获批准的CRISPR基因疗法是用于镰状细胞性贫血等血液疾病的方法，其中经过编辑的血细胞被重新注入经化疗、骨髓被破坏的患者体内。

2024年1月11日在《自然生物技术》杂志上发表了一种新的CRISPR-Cas9精确靶向递送方法，该方法可以在体内对非常特定的细胞亚群进行基因编辑，这是朝着可编程递送方法迈出的一步，，该方法免去了在给予患者编辑过的血细胞之前消除患者骨髓和免疫系统的需要。

这种递送方法是在加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna实验室开发的，Jennifer Doudna是CRISPR-Cas9基因组编辑的共同发明者，该方法将Cas9编辑蛋白包裹在一个膜泡中，并将RNA引导到膜泡中，该膜泡上装饰有单克隆抗体，这些单克隆抗体可以定位特定类型的血细胞。

包膜病毒通过从其入侵的细胞中出芽的方式而获得外壳。CRISPR-Cas9研究人员将这种行为结合起来，生产出包裹Cas9蛋白（深绿色）、引导RNA和转基因的包膜衍生载体。这些负载载体靶向并入侵特定类型的人类T细胞，在那里它们同时编辑并插入新基因，将T细胞变成抗癌战士。

目前，大多数被批准的基因疗法，包括涉及CRISPR-Cas9的基因疗法，在体外编辑，再返回给患者后，都产生可神奇的魔力。

图1. 包膜病毒组装

作为演示证明，创新基因组学研究所（IGI）Doudna实验室的CRISPR研究人员汉密尔顿选择了免疫系统的T细胞，这是一种革命性的癌症治疗的起点，称为嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法。汉密尔顿和她的同事治疗了装有人源化免疫系统的活小鼠，并将其人类T细胞转化为CAR T细胞，能够定位并消除另一类免疫细胞，即B细胞。

这一壮举是基因治疗原理的实证，展示了使用这种载体方法，包膜运载工具，靶向和编辑活动物体内的血细胞和其他类型细胞的潜力，以及最终造福人类的潜力。

该方法涉及多路复用靶向分子，即在设计的粒子上有两个或多个靶向分子，它们与靶细胞相互作用，有点像计算机中的"与门"，即只有当两个事件同时发生时才起作用的逻辑电路。当颗粒通过两种抗体-配体相互作用结合时，就能够获得更有效的递送。在用T细胞靶向载体处理小鼠后，研究人员在目标细胞类型T细胞中观察到基因组工程的作用，而不是在肝肝细胞中观察到。

对于所有将基因传递到细胞中的方法来说，高度特异性的靶向都是困难的。特别是肝细胞，通常会占用其他地方的运载工具。

病毒包膜Viral envelopes

病毒包膜是基因治疗实验技术之一。许多人使用包裹病毒的外层，即病毒被清空，并填充有纠正性转基因或基因编辑工具，如CRISPR-Cas9。其他方法还有，包括IGI研究人员正在探索的一种方法，依赖于将穿透细胞的Cas9蛋白直接注射到小鼠体内，以实现基因组编辑。

图2. 比较病毒，非病毒和EDV传递的图形

将基因编辑工具传递到细胞中的传统策略需要病毒编码和表达CRISPR-Cas工具（图2A），或者直接将编码Cas9的信使RNA或预先形成的Cas9核糖核蛋白（RNP）插入靶细胞（图2B）。病毒方法的优点是颗粒外部的蛋白质非常有效地结合到细胞外部，以提供病毒编码的CRISPR工具。第二种方法确保了Cas9编辑机器的寿命短，因此它不会开始切割目标基因以外的基因。汉密尔顿和她的IGI同事使用了一种不同的方法：将Cas9 RNP和转基因包装在一个有包膜的颗粒内（图2C）。

流感等包膜病毒有一层更灵活的外壳，外层由萌芽细胞的外膜组成。

在2021年的一份文章中，汉密尔顿证明了HIV-1病毒的外壳可以在培养物（离体）中编辑T细胞，并将其转化为CAR T细胞。病毒包膜的改变如此之大，以至于她现在将其称为包膜递送车或EDV。

EDV的一个关键方面是，它们的外壳可以很容易地用一个以上的抗体片段或靶向配体修饰，这大大提高了靶向特异性。其他基因传递载体，如腺相关病毒和脂质纳米颗粒，已被证明更难精确靶向。

研究人员正在努力使所有这些载体对一种细胞类型具有特异性，并使其去靶向其他细胞类型。

汉密尔顿说：“你可以显示抗体或抗体片段，就像我们一直在做的那样，但旁观者T细胞的摄取量仍然很高。你可以将递送偏向一种细胞类型，但你仍然可以观察到旁观者细胞的吸收。我们检查了肝脏，看看我们递送是否偏离了目标，但没有发现。我认为用更传统的无包膜病毒载体或脂质纳米颗粒实现这一目标将更具挑战性。"

在这篇论文中，汉密尔顿和她的同事试图在体内复制《科学》杂志2020年报道的一种成功用于癌症患者的离体CRISPR CAR T细胞疗法。该疗法不仅为靶向癌症细胞的受体提供了转基因，而且使用CRISPR敲除了不靶向癌症的受体。

加州大学伯克利分校的研究人员成功地敲除了天然T细胞受体，并为靶向B细胞的受体传递了转基因，B细胞是癌症细胞的替代物。由于CRISPR/Cas9蛋白与转基因一起在同一EDV中递送，因此它的寿命比递送Cas9基因的方法更短，这意味着更少的脱靶编辑。

该研究实现的目标是跳过了必须在体外设计细胞的整个步骤。他们的目标是系统地给药一种载体，该载体可以在体内特定的细胞类型中进行基因递送和基因敲除，使用这种递送策略在体内制造基因编辑的CAR-T细胞，希望能够简化在体外制造基因编辑CAR-T细胞的复杂过程。

图3. 一种简化的CRISPR/Cas9核糖核蛋白示意图。

图3显示，Cas9蛋白被包裹在一个包裹着抗体片段的递送载体中（左），使其进入一种特定类型的细胞（右）。在细胞内，Cas9靶向编辑的DNA显示为灰色。

Doudna和她的实验室在继续提高EDV介导的递送效率。该实验室专注于体内工作的载体的最终目的是使CRISPR疗法更广泛、更便宜。在《连线》杂志最近的一篇文章中，Doudna提到了当今昂贵的基因疗法的不公平性，部分原因是患者接受骨髓移植时需要延长住院时间。

Doudna写道：“镰状细胞病的治疗预计每位患者的费用将超过200万美元，而美国只有少数地方有技术能力提供这种治疗。”她因共同发明CRISPR-Cas9基因组编辑而获得2020年诺贝尔化学奖。“允许体内提供基因编辑疗法和改进制造的新技术将是降低价格的关键，大学、政府和行业之间的独特合作伙伴关系也是如此，将减轻负担作为共同目标。仅仅制造这些工具是不够的。我们必须确保它们能送达最需要的人手中。”

美格小Tips:

什么是旁观者T细胞？

旁观者T细胞英文全称是bystander T cells。如果T细胞浸润肿瘤后，不识别肿瘤抗原, 或者识别与癌症不相关的靶点，则将其视为旁观者T细胞，也简称旁观者细胞。

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