单细胞测序揭示了成年斑马鱼脑中新生神经元的多样性
斑马鱼是再生大师：如果它的脑细胞由于损伤或疾病而丢失，它可以简单地繁殖它们，人类则不是，人类只有在胎儿期才会出现这种情况。
然而，斑马鱼在进化上与人类有亲缘关系，拥有与人类相同的脑细胞类型。人类隐藏的再生潜能也能被激活吗？
对中风、颅脑损伤和目前无法治愈的疾病，如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症的治疗是否可行？
德国Dresden的科学家利用斑马鱼进行研究，已经成功地确定了斑马鱼中新形成的神经元的数量和类型。斑马鱼在受伤后大量形成新的神经元，并将它们整合到神经系统中，这就是它们惊人的大脑再生能力的原因。
这项研究是来自德国Dresden再生疗法中心CRTD、Dresden概念基因组中心，以及Max Planck研究所的科学家合作的成果。
由CRTD的Christian Lange博士和Michael Brand博士领导的研究小组使用了成年转基因斑马鱼，它们的前脑能够识别新生神经元。
斑马鱼的前脑相当于人类大脑皮层，是大脑最大和功能最重要的部分。研究小组用单细胞测序法研究了新生和成熟神经元、以及脑干细胞。
研究人员用放射胶质子代的短期谱系追踪，从稳态成年大脑的her4.1+放射状胶质细胞系中分离出新生神经元。利用单细胞测序对放射状胶质细胞、新生神经元和成熟神经元进行转录组分析，确定了不同的转录谱，包括每个群体的新标记。
他们发现了新生神经元的特异性标记，能够全面分析斑马鱼成年大脑中新形成的神经元类型。
研究人员发现了两种新形成的神经元：在大脑区域之间建立联系的投射神经元和内部神经元，它们可以微调投射神经元的活动。研究人员还对小鼠脑细胞测序获得的数据进行了调查，发现斑马鱼和小鼠具有相同的细胞类型。
进一步分析表明，这些细胞类型与哺乳动物脑内的神经原细胞具有同源性，证实了在快速繁殖的放射状胶质细胞中的神经原性定型，表明在成年斑马鱼端脑中产生了谷氨酸能投射神经元。
这也使得这些结果与人类高度相关。
在大多数哺乳动物中，成体神经发生局限于海马齿状回颗粒下区和侧脑室室管膜下区的主要神经发生微环境neurogenic niches。
新生神经元NBN只整合到齿状回的颗粒区，啮齿动物的嗅球区和人类的纹状体区。
在成人神经发生的这些靶区之外，NBN的整合基本上是不存在的或是极小的，大多数大脑区域，包括大脑皮层，显示出NBN整合和存活的可能性有限，即使在损伤诱导的神经元细胞死亡之后。
因此，可能性低是在损伤或神经退行性变后，想让NBN 在大多数脑区整合、修复的重要障碍。
为了开发细胞替换的治疗策略，需要更好地了解在这些脑区可以允许神经发生neurogenesis，即生成新的神经元，和神经元整合的机制。
在成年斑马鱼脑中，我们在整个轴突中发现了17个不同的增殖区。
这些增殖区伴随着相邻的区域，新生神经元在这些区域整合。在端脑中，放射状胶质细胞radial glia， RG, 的胞体位于脑室带(ventricular zone， VZ)，但它们的突起横跨整个端脑。
在端脑背侧（大脑皮层），成年后的RG分裂并产生神经元，这些神经元经过短距离迁移到薄壁组织的邻近脑室周围区域PVZ，在那里它们被添加到回路中。
PVZ中的细胞表达谷氨酸能投射神经元发育的标记物，如tbr1、neurod1和bhlhe22。
与发育中的哺乳动物前脑相似，第二组神经祖细胞，表达标记巢蛋白，存在于纹状体腹侧端脑的VZ中，其表达GABAergic中间神经元祖细胞的标记物，例如DLX2和DLX5A。
腹侧产生的神经元向端脑实质进行长距离迁移，使人想起哺乳动物发育过程中的神经元间切向迁移。
这些数据表明，在斑马鱼端脑中，与同源哺乳动物脑区相对应的背侧大脑皮层和腹侧纹状体以进化保守的方式显示出持续的神经发生和NBN整合。
与哺乳动物相比，斑马鱼通过诱导
i）桡神经胶质细胞增殖，
ii）神经元生成和
iii）实质中新生分化神经元的整合，有效修复端脑损伤后的损伤。
损伤后的数周和数月内，受损半球的损伤部位明显缩小，最初被破坏的神经元连接重新出现。
谱系追踪显示这些再生神经元来源于RG并长期存在。
导致这种修复过程的分子机制目前还不完全清楚。
以前的研究集中于，在体内平衡或损伤后，调节RG，作为NBNs的来源，而未成熟的、神经性的前体细胞和神经元在其成熟和融入成人端脑的不同阶段的作用仍然不清楚。
最近，在脊椎动物胚胎或斑马鱼幼年大脑中，我们使用单细胞测序（单独或与细胞条形码结合）重建了细胞分化轨迹。
然而，成年端脑的神经发生和NBN分化尚未用这些方法进行研究。
为了深入了解NBNs在斑马鱼前脑成体神经发生中的作用和调节，我们设计了一种追踪RG、RG衍生NBNs和MNs的策略，允许它们直接、特异地从异质细胞群中分离（即前瞻性分离）。
单细胞测序的转录组分析显示，RG衍生的nbn之间存在明显的异质性，可以分析成年斑马鱼前脑的分化轨迹。
为了按预期分离成年斑马鱼端脑放射状胶质细胞的神经子代，例如NBN, 基于荧光蛋白在细胞类型特异性中的保留, 即荧光监测，我们建立了一种短期谱系追踪方法。
为此，我们将Park等人的神经元监测管线elavl3:gfp与Kroehne的标记RG的her4.1:mcherry监测管线结合起来。
尽管在her4.1启动子的控制下mcherry mRNA的表达仅限于放射状胶质细胞，并在NBN中迅速下调，但荧光蛋白，半衰期约为24小时，传递给分裂中的放射状胶质的神经子细胞，数量是可检测到的。
利用这种方法，在her4.1-mcherry，elavl3-GFP鱼的端脑中，新生神经元可以被确定为mcherry/GFP双阳性细胞（图1A）。
图1
用流式细胞仪分析her4.1:mcherry；elavl3:gfp前脑，包括端脑和前间脑（见图1B及材料和方法），我们发现mcherry水平高的细胞为GFP阴性。
相反，mcherry水平低但可检测到的细胞对神经元标记elavl3:GFP明显呈阳性（图1C）。
这些结果证实了我们的假设，即在her4.1-mcherry-elavl3-GFP-鱼的端脑中，NBNs可被鉴定为mcherry/GFP双阳性细胞，而当真实RG的mcherry平均水平较高，则GFP为阴性。
定量分析显示mcherryhigh/GFPneg-RG占8.7%，mcherrylow/GFPpos细胞（称为NBNs）占全部前脑活细胞的10.9%。
成年前脑以成熟神经元MN，mcherryneg/GFPpos，为主，占72.1%，谱系标记阴性细胞占8.2%（图1D）。
通过流式细胞术直接成像分离的细胞，证实了mcherry和GFP同时呈阳性的单个细胞的存在，排除了这些细胞可能代表表达GFP或mcherry的双重细胞的可能性（图1E）。
为了验证mcherrylow/GFPpos双阳性群体中富含成年神经元，我们进行了EdU脉冲追踪分析。
成年her4.1-mcherry-elavl3:gfp-fish每隔12小时注射3次EdU，以标记成年大脑中足够数量的增殖细胞。
在最后一次注射后2小时、7天或4周，评估EdU掺入，以分别识别最初增殖细胞的增殖细胞及其直接子代、早期子代和晚期子代（图2A）。
图2
追逐2小时后，mcherryhigh/GFPneg-RG是增殖最强烈的细胞类型，其增殖率为7.8±2.1%，mcherrylow/GFPpos细胞仅为0.8±0.3%，mcherryneg/GFPpos成熟神经元仅为0.1±0.01%（图2B、C）。
相比之下，EdU追踪后7h，mcherrylow/GFPpos神经元EdU掺入率显著增加至11.6±2.1%，与mcherryhigh/GFPneg-RG的10.6±3.5%，mcherryneg/GFPpos神经元EdU掺入率的1.5±0.8%相似。
追踪4周后，mcherrylow/GFPpos神经元的EdU掺入量比追逐7天时减少到0.7±0.1%，mcherryhigh/GFPneg-RG神经元的EdU掺入量有减少的趋势（3.9±1.6%），而mcherryneg/GFPpos神经元的EdU掺入量没有明显变化（0.6±0.1%）（图2B，C）。
这些数据表明，mcherrylow/GFPpos神经元是专为成年产生的神经元而富集的，并表明这些细胞代表了一个短暂的群体，在从mcherryhigh/GFPneg-RG产生后，至少7天内保持her4.1:mcherry，但4周后不再保持her4.1:mcherry。
总之，这些数据提供了确凿的证据，证明成年斑马鱼前脑放射状胶质衍生的NBNs可以通过保留放射状胶质表达的荧光蛋白和同时表达的神经元标记物来鉴定。
单细胞测序鉴定成年斑马鱼端脑放射胶质细胞、新生神经元和成熟神经元的转录组。
接下来，利用我们的血统追踪协议，我们对6条鱼的成年端脑中171个RG（mcherryhigh/GFPneg）、169个NBNs（mcherrylow/GFPpos）和30个成熟神经元（MNs，mcherryneg/GFPpos）进行分类，并使用SMART Seq2对它们进行测序。
平均每个细胞检测到1408个表达基因和191k个转录本。264个细胞（71%）通过了我们的质量控制。
分别来自RG、NBN和MN-FACS门的76、162和26个细胞被用于下游分析。
与我们的谱系追踪范式一致，细胞分类为RG，而不是分类为神经元，表达放射状胶质标记物（her4.1，cx43，id1，s100b）（图3A）。
图3
这些数据表明，放射状胶质衍生的NBNs是一个异质群体，至少包含3个具有不同转录谱的群体（NBN.1、NBN.2和MN簇的一部分）。
它们与放射状胶质前体不同，但NBNs的一个子集与成熟的、突触整合的神经元聚集在一起，表明这一群体代表了成年神经元的更成熟状态。
有趣的是，由于细胞类型特异性标记的表达，一个由NBN组成的小簇，没有一个表达her4.1，但是表达了elavl3，被鉴定为少突胶质细胞前体。图3B，C；S4A
这些数据提供了有力的证据，证明her4.1表达的RG在正常成年端脑中产生了由不同神经元和少树突胶质细胞类型组成的异质和多样的后代。
所有的细胞类型显示出斑马鱼细胞与其最相似的小鼠相对应的相似性分布，提示对于每个斑马鱼细胞类型，相应的细胞群体存在于哺乳动物海马中（图S5C）。为了推断斑马鱼细胞簇内细胞特性的异质性，我们还确定了每个斑马鱼细胞对应的、最相似的小鼠细胞的细胞类型。
结果表明，成年斑马鱼脑内形成RG簇的细胞主要对应于小鼠脑内不同类型的胶质细胞，即不同成熟阶段的星形胶质细胞和放射状胶质样神经干细胞（RGLs）、少量对应于神经母细胞、OPCs和小胶质细胞的神经源性中间祖细胞（nipc）。
斑马鱼OPC只与小鼠OPC相对应。
这些分析揭示了成年斑马鱼大脑神经源性细胞类型与发育中和成年海马神经源性细胞类型的转录相似性。
特别是，NBN.1细胞显示出与神经母细胞和未成熟神经元的显著相似性，支持其在拟时分析中作为直接RG子代的定位。
某种再生能力也存在于人类中，我们正在努力唤醒这种潜能。对于了解移植神经元与现有神经元互联的条件，从而使人类重新获得以前的精神表现，这个研究结果十分重要。
尽管不同物种之间的程度差异很大，成年后额外神经元的生长，并整合到大脑回路中的现象在脊椎动物中广泛存在。
在这些研究的基础上，研究人员将进一步研究斑马鱼的再生过程。特别是研究创伤性脑损伤后新神经元的形成及其整合，希望获得与可能的治疗相关的见解，帮助受伤和中风或患有神经退行性疾病的人。
参考文献
Single cell sequencing of radial glia progeny reveals diversity of newborn neurons in the adult zebrafish brain
Christian Lange, Fabian Rost, Anja Machate, Susanne Reinhardt, Matthias Lesche, Anke Weber, Veronika Kuscha, Andreas Dahl, Steffen Rulands, Michael Brand
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