10xGenomics平台单细胞RNA-Seq测序详解
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什么是RNA-Seq测序？
RNA-Seq测序，又称RNA sequence测序，即转录组测序，简称RNA测序，就是用高通量测序技术进行测序分析，反映出mRNA,smallRNA,noncodingRNA等或者其中一些的表达水平。
什么是转录组？
转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。
单细胞转录组测序(Single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq) 是在单个细胞水平对mRNA 进行高通量测序的一项新技术，其原理是将多细胞生物分离的单个细胞中微量的转录组mRNA 通过高效扩增后再进行高通量测序。单细胞转录组测序能够有效解决组织样本无法破解的细胞异质性难题以及常规RNA-seq 被掩盖的细胞群内的转录组异质性难题，有助于发现新的稀有细胞类型，并深入了解发育过程中的表达调控机制。近年来，已有多种单细胞测序技术及平台应用而生。其中，基于微流控技术的平台通量有限，基于板型技术的平台有耗时的荧光激活细胞分选过程，近来基于液滴技术的平台的10xGenomics 凭借其单次成千上万的细胞通量、周期短及成本低成为目前主流的单细胞转录组测序平台。
其技术优势包括:
1）细胞通量高：能同时进行8 个样本，每个样本细胞数适用范围为100-80,000 个；
2）项目周期短：10min 内实现对上万个细胞的封装，1 天内即可完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增及建库，且可同时获得上万个细胞的分析结果，大大缩短项目周期；
3）捕获效率高：单个细胞捕获效率高达65%，高效捕获每个细胞中的表达基因；
4）真正意义单个细胞：单个液滴捕获到多个细胞的概率极低0.9%/1000 cells，分析上通过严格质控，利用Barcode 信息及UMI 的文库设计(具体见2.2 介绍)，实现真正意义上的单细胞测序；
5）应用范围广：对细胞大小及类型无限制，已成功应用于识别细胞周期、肿瘤细胞异质性研究、鉴定罕见细胞类型[10]、免疫细胞分型[11]、干细胞分型[12,13]、疾病分型等领域；
6）价格优惠：相较于其他单细胞平台，如Fluidigm C1 平台、Illumina BioRad Single CellSolution 平台或传统手工扩增方法等，价格大幅优惠。
RNA-seq测序原理
基于10X Genomics 平台的高通量单细胞 RNA Seq技术是利用液滴法的原理，使用GemCode技术，通过控制微流体的进入，将带有 barcode、UMI（Unique Molecular Index，分子标签）、引物及酶的凝胶珠（Gel Beads）与单细胞混合，从而实现大规模的单细胞分离，以及单细胞文库构建的技术。
图1 10X Genomics 技术原理示意图
10X Genomics平台的液滴封装大约有 50%的捕获效率，可在 6 分钟内完成。分离完成后会形成一个 GEM（Gel in Emulsion）的液滴结构，在这个液滴结构内，包含了一个凝胶珠，一套反应需要的试剂以及目标细胞，通过一套 75 万个 barcode 序列系统地对每个液滴进行唯一标记，随后上机测序，再利用信息分析的方法进行 barcode 序列的拆分，可实现一次 100-10000 个细胞的分离和文库构建。
关键名词解释：
GEM（10X Genomics Gel in Emulsion），一个由 mRNA、磁珠、乳液组成的液滴状反应系统，后续的细胞分选、反转录的反应都是在这个液滴反应系统中进行。GEMs 的结构确保了＞90% 的油滴内反应产物都可以顺利用唯一的 barcode 分子标记。
GEM 具体结构可参考以下图解：
图2 GEM（10X Gel in Emulsion）结构示意图
RNA seq测序流程
实验流程
首先将样本制备成单细胞悬液，随后进行上机前细胞计数和细胞活率检测，若细胞活率≥80%，则将细胞浓度调整为 700-1200 个／μL。将制备好的细胞悬浮液利用微流控芯片，将带有细胞标签序列（cell Barcode）的凝胶珠（bead）和细胞包裹在液滴中。在液滴中，细胞破裂， 释放的mRNA 与凝胶珠上的细胞标签序列相连，形成单细胞GEMs 结构（Gel Bead in Emulsions）。细胞的 mRNA 在液滴中进行逆转录反应形成 cDNA，随后破乳，进行 cDNA 的文库构建。通 过文库序列上的细胞标签序列可以区分目标序列来自于哪一个细胞。
细胞和反应试剂在微流控芯片上的一条通道中，凝胶珠在另一条通道，共同形成 GEM。在每个 GEM 中独立进行反转录，之后带有标签的 cDNA 将被混合然后扩增再进行文库构建。
图3 GemCode 平台单细胞 RNA-Seq 工作流程图
测序策略
测序平台：Illumina平台
测序读长：PE100
数据量推荐：
细胞系样本，建议每个细胞平均测：50,000 条 Raw Reads；
组织样本，建议每个细胞平均测：500,000 条 Raw Reads；
PBMC（外周血单个核细胞）样本，建议每个细胞平均测：50,000 条 Raw Reads。
RNA-seq数据分析
信息数据分析流程
测序得到的原始数据我们称之为 Raw reads，之后我们会根据 10X Genomics单细胞RNA Seq独特的文库结构，对 Reads 的 Barcode 、UMI 和插入片段部分进行拆分，之后插入片段部分将比对到参考基因组，然后统计比对到各个区域的比例，并进行表达量统计；基于表达量的结果， 进行细胞时间轨迹预测，细胞聚类等分析，基于差异表达的结果，进行 KEGG 富集，GO 富集，蛋白互作网络分析等。
RNA Seq测序数据信息分析内容
表1 信息分析内容列表
信息分析条款 | 信息分析内容 |
标准信息分析 （需要基于良好的参考序列，且每个样本拆分出的细胞数目上下浮动在20%或以内的误差皆属于正常范围） | 1. 测序结果统计 2. 比对结果统计 3. 定量分析 4. Cell Ranger 分析 4.1 细胞聚类分析-Cell Ranger 4.2 差异基因鉴定-Cell Ranger 4.3 Marker 基因鉴定-Cell Ranger 4.4 差异表达基因 GO 功能分析 4.5 差异表达基因 Pathway 功能分析 4.6 差异表达基因 TF 编码能力预测 4.7 差异表达基因蛋白互作分析 4.8 基因相关性网络分析 5. Monocle2 分析 5.1 细胞聚类分析-Monocle2 5.2 差异基因鉴定-Monocle2 5.3 Marker 基因鉴定-Monocle2 5.4 细胞轨迹分析-Monocle2 5.5 差异表达基因 GO 功能分析 5.6 差异表达基因 Pathway 功能分析 5.7 差异表达基因 TF 编码能力预测 5.8 差异表达基因蛋白互作分析 5.9 基因相关性网络分析 |
高级信息分析 | 基于 SC3 软件进行的细胞轨迹、差异表达分析。 |
定制化信息分析 | 可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容。 |
4. RNA-seq测序送样建议
基于 10X Genomics平台的高通量单细胞RNA-Seq测序产品，接收的样本类型如下：
1) 处理好的细胞悬液。
客户需寄送处理好的细胞悬液，悬液需要完整且有活性的细胞数量不少 1x106个。样本处理及建议如下：
. 细胞培养物（细胞系、原代培养细胞等）；
镜检细胞状态良好，生长密度达 80%；
按照 2×106 -1×107 /mL 将细胞用冻存液重悬混匀，分装至冻存管中，每个冻存管不少于 500ul 细胞悬液（冻存液配制：90%FBS+10%DMSO）；
冻存方法：室温准备梯度降温盒，内置新鲜异丙醇约 250 mL（异丙醇可重复使用3-5 次），将装有细胞悬液的冻存管放入梯度降温盒，置于-80℃冰箱过夜；
短期储存可于-80℃冰箱放置，长期保存置于液氮罐，需寄送则全程用干冰运输。
. 血液（不少于 5mL EDTA 抗凝血）；
抽取人外周血 5mL 至 EDTA 抗凝管中。 淋巴细胞分离液和血样在 20℃水浴箱中复温 20min， 所有操作在无菌条件下进行；
等量 HBSS 稀释全血；
取淋巴细胞分离液 2mL，放入 15mL 的离心管，将离心管倾斜 45°角，用枪吸取稀释后的全血 4mL，在离分层液面上 1cm 处，沿离心管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰（血样与分层液体积比例约为 2:1）；
20℃， 500×g 水平离心 20min（离心机降速设置中一定要设置成 no break），离心后管中内容物分为三层，上层为血浆（内含细胞碎片），中间层为分层液，底层为红细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（ 白膜层，薄），单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞；
弃去最上层血浆， 小心将 200µl 移液枪插入白膜层，沿离心管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中；
加入 5mL HBSS 洗涤 300g 离心 10min，弃上清；
加入 1mL HBSS 重悬细胞，于显微镜下计数，以备按照 2×106-1×107/mL/管细胞浓度进行冻存，冻存液配制： 90%FBS+10%DMSO；
冻存及运输方法同细胞系样品。
. 组织样本
组织制备细胞悬液后冻存，具体制备方法可参考以下：
手术后将切下的组织浸于 PBS/HBSS 管中移至超净台，用 PBS/HBSS 将新鲜组织清洗 1 次，在 60mm 细胞培养皿中用无菌手术剪将新鲜组织剪碎成约 0.5mm3 的组织匀浆；
以上皮组织为例，按下表的比例消化至细胞悬液：37℃孵育 2 小时，其间每隔 30分钟颠倒混匀一次：
表2 上皮组织细胞悬浮液配比
试剂 | 体积/终浓度 |
组织匀浆 | X |
培养液(90%DMEM+10%FBS) | (5-10)X |
胶原酶 I (Gibco Cat.No.17100-017) | 1mg/mL |
胶原酶 IV(Gibco Cat.No.17104-019) | 0.5mg/mL |
注：对于不同组织类型要根据文献使用不同的酶和消化方法
消化完成后，在超净台内将细胞悬液用 40μ0 细胞筛过滤，收集滤过液，4℃，500×g 离心5min 去上清，保留管底沉淀；
加入 1mL HBSS 重悬细胞，于显微镜下计数，以备按照 2×106—1×107/mL/管细胞浓度进行冻存；
冻存及运输方法同细胞系样品。
. 肿瘤组织样本
由客户进行组织冻存，美格进行肿瘤组织的解离；
取 0.1-1g 的肿瘤组织到直径 10cm 的培养皿中，使用已灭菌的剪刀和镊子将肿瘤组织剪成 2-4mm3 大小的组织块，同时尽量去除肿瘤样品上非肿瘤成分（如脂肪、纤维等）；
将剪碎的肿瘤组织转移到 15mL 离心管中，并加入 PBS 对组织块进行清洗，300g 离心 5 分钟，然后小心去除上清（若觉得有需要，可以再重复清洗一次）；
将清洗后的组织块转移到冻存管中，并加入 1mL 的冻存液（参考配方80%DMEM+10%FBS+10%DMSO）对组织块进行重悬混匀，室温放置 10 分钟；
室温条件下准备梯度降温盒，内置新鲜异丙醇（异丙醇可重复使用，但不能超过3 次），将装有组织块悬液的冻存管放入梯度降温盒，置于-80℃过夜；
冻存好的样品可放置在-80℃低温中进行短期保存，若要长期保存，则需放在液氮中；
样品寄送美格需全程保证干冰运输，并保证样品到达美格时干冰仍剩有 15kg 以上（可依照一天消耗 1kg 干冰估算，温度较高或运输距离较远时可适当上调消耗量）；
以上组织冻存方法仅供客户参考，若客户自己原来就有一套冻存方法，优先使用客户的方法进行冻存处理。
RNA seq案例分析
案例. 大规模单细胞并行的数字化转录图谱绘制
文章：Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells
杂志： Nature Communications
影响因子： 12.124
细胞类型：外周血单核细胞
研究展示：
对移植病人中分离出的骨髓单核细胞的转录图谱进行分析，比较捐献者与被捐献者的嵌合情况。通过进行单细胞 RNA-Seq 的分析可以实时监测急性髓性白血病人移植后，以及捐献者的免疫细胞和受捐献者的细胞之间的动态变化。文章一共进行 29 个样本的单细胞 RNA-Seq，合计 250,000 个细胞。并对 68,000 的外周血单核细胞进行转录图谱绘制，进行免疫细胞亚群的系统性分类。找到主要的细胞亚群同时，发现了新细胞亚群(0.3% & 0.5%) ，以及对细胞亚群二级关系划分。
图4 68,000 个细胞的高通量单细胞 RNA-Seq，可以清晰的被分成不同功能的细胞亚群
（a） 整体细胞的表达量及细胞数中位数分析。
（b）t-SNE 细胞亚群聚类分析。
（c）不同关键基因的表达量热图分析。
（d）基于不同关键基因的细胞亚群聚类及表达量丰度分析。
2. 通过对这些临床病例的外周血单核细胞进行大规模的单细胞 RNA-Seq，可以观察到细胞亚群的组成比例，以及在 HSCT（Hematopoietic Stem Cell Transplantation）患者的骨髓中可能存在的残留病灶情况，这弥补了常规临床治疗中对这一部分信息的缺失。
图5 移植后骨髓单核细胞的基因型以及对应的单细胞表达谱分析。
(a) 通过 tSNE projection 分析软件对病人移植前和移植后的细胞进行二维聚类，每个点为一个细胞，不同的颜色表示其所属于不同的细胞亚群。
（b）表示了不同的样本中，细胞亚群的比例情况。
9. RAN seq常见问题FAQ
Q1. 通过 10X Genomics 平台进行单细胞 RNA-Seq 的组织样品，是否可以提供前期处理的方法？
答: 目前单细胞送样建议手册上有提供通用的组织消化方法。
不同组织存在组织及细胞的特异性，使用通用组织消化方法的效率会因组织类型差异，存在消化效率的差异。因此，建议客户自行使用组织特异性的针对性消化方法进行消化。
Q2. 100 个单细胞样本可以使用 10X Genomics平台进行单细胞 RNA-Seq 吗？
答: 每个文库最低可以处理 100 个细胞样本，但 10X Genomics 单细胞 RNA-Seq 产品建议细胞的最低送样量为 106 个以上的细胞。具体请参考产品说明文档上的送样建议部分内容。
Q3. 10X Genomics平台下机的文库，可以在 XTen 平台上面进行测序吗？
答: 不建议在 XTen 平台上进行测序。官方推荐的测序平台为 HiSeq4000 平台，PE100 的测序读长策略，部分项目在 XTen 平台上测序后，Q30 可达到 70%以上，但也有部分项目测序失败的，具体失败原因未能确定是测评平台原因或样本活率或其他原因。
Q4. 10X Genomics平台分离的单细胞会有细胞大小的限制吗？
答: 细胞大小会有一定的限制，但限制条件相对固体芯片没有那么严格。同时，生产实验过程中，为了避免细胞出现长团情况，在进行 10X 平台细胞分离处理前，会做一个粗略的过筛处理。
Q5. 请问 10X Genomics单细胞RNASeq测序可以进行可变剪切等结构变化分析吗？
答: 10X Genomics 单细胞 RNA-Seq 产品主要定位为基因表达定量分析为主，数据不建议进行可变剪切等基因结构变化分析。如需研究结构变异信息，可进行单管单细胞 RNA 测序。
Q6. 10X Genomics 单细胞RNA Seq测序采用的 3’端扩增技术与 Smart-seq2 的扩增技术有什么区别？
答: Smart-seq2 扩增技术针对是的 3’~5’端全部的 mRNA；3’端扩增技术主要是扩增 3’端，是否能延伸至 5’端，取决于酶的活性等系列实验因素决定。因此，扩增产物的长度上会有一定的区别和差异。
Q7. 如果客户现场分离了 100个细胞，并检测出细胞活度很高，问：可否直接使用 100个细胞进行 10X Genomics平台上机？
答: 不建议。因为 10X Genomics 单细胞 RNA-Seq 最低建议细胞送样量为 106 个细胞，且活率建议在 90%以上。
Q8. 单个细胞的测序 reads 数目应该在多少合适？
答: 根据研究目的，细胞类型，以及分析内容的差异，对测序数据量会有不同的要求。针对不同的细胞类型及其相应的测序饱和度经验值，建议：细胞系样本，平均每个细胞测 50,000 条Raw Reads；组织样本，平均每个细胞测 500,000 条 Raw Reads；PBMC 样本，平均每个细胞测50,000 条 Raw Reads。同时，不同研究目的，以及不同分析内容，视具体情况而定。
Q9. 细胞物种没有相应的参考基因组，可以做这个产品吗？
答: 产品分析需要基于一个良好注释和组装的参考序列。基因注释不完善或只注释到转录本， 没有注释到基因等的不完善参考序列，会出现占用内存过多，即使对转录本进行去冗余及重新构建，跑出的结果可能会不太好，需要客户明确其风险因素。
参考文献
[1] Navin N E. The first five years of single-cell cancer genomics and beyond[J]. Genome research, 2015, 25(10): 1499-1507.
[2] Picelli S, Faridani O R, Björklund Å K, et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2[J]. Nature protocols, 2014, 9(1): 171-181.
[3] Usoskin D, Furlan A, Islam S, et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single- cell RNA sequencing[J]. Nature neuroscience, 2015, 18(1): 145-153.
[4] Zheng G X Y, Terry J M, Belgrader P, et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells[J]. Nature communications, 2017, 8: 14049.
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