用编程CAR-T细胞杀死癌症
广州美格生物提供全系列的CRISPR Cas蛋白，用于基因编辑、快速检测。想了解详情，请点击：CRISPR Cas蛋白
设计用于表达肿瘤抗原特异性嵌合抗原受体的T细胞CAR-T,在血液系统恶性肿瘤患者中具有高的完全应答率。
但是CAR-T细胞在癌症治疗的广泛应用还有许多挑战，包括治疗的相关毒性和癌症复发。
由于肿瘤特异性抗原的缺乏和肿瘤微环境的免疫抑制效应，为靶向实体肿瘤的CAR-T细胞带来了额外的障碍。为了克服这些挑战，可以用遗传模块对T细胞进行编程，提高他们的治疗潜力和特异性。
每一个T细胞都有一个非常灵敏和特异的T细胞受体（TCR），它不断地检测生物体中的“非自体”信号，在识别外源肽时触发级联免疫应答。
T细胞是外来物体的有力和精确杀手。
图一，CAR-T结构。
作为机体对恶性生长的反应的一部分，肿瘤经常被免疫细胞侵入。
在这些免疫浸润中，肿瘤浸润淋巴细胞（TILS）包括了在癌细胞中存在的突变蛋白特异的T细胞。
这些TIL可以从患者的肿瘤组织中分离出来，体外扩增到较多的数量，然后转移回患者体内，以引起持久的抗肿瘤反应。
然而，这个过程有几个限制：TILS需要在手术期间收获，有些癌症中发现数量不够，并且在许多情况下扩增不好。
一种潜在的更广泛的治疗方法包括从血液中收集多克隆T细胞，并通过基因工程，插入编码特异性已知的肿瘤抗原TCR基因。
例如，靶向NY-ESO-1抗原的工程TCR的T细胞在治疗多发性骨髓瘤和滑膜细胞肉瘤的患者中取得了有希望的结果。
使用肿瘤特异性TCRs能够靶向膜和胞质蛋白；但不幸的是，癌症可以通过下调主要组织相容性复合体（MHC）蛋白、或抗原加工和预处理所需的其他因素来逃避这种内源性识别和应答程序。使肿瘤细胞在T细胞中不可见。为了克服肿瘤的逃避策略，T细胞特异性可以以MHC独立的方式指向肿瘤相关抗原（TAAS）。
这可以通过使用嵌合抗原受体（CAR）来实现。
CAR结合了高亲和性识别域的特异性，最常见的来源于单克隆抗体（mAb），具有T细胞的溶细胞特性。
使用CAR修饰的T细胞对血液系统恶性肿瘤显示出前所未有的效力，如CD19-CAR-T细胞治疗的几个临床试验所例证，其对难治性B细胞恶性肿瘤的完全缓解率为50～90%。
这些结果导致了美国FDA在2017下半年批准了第一种CAR-T疗法。
CAR的分子结构
CAR将抗原识别事件转变为信号级联，唤起T细胞效应器功能，如细胞毒性因子和促炎细胞因子的分泌。
这些合成受体的基本成分是细胞外抗原靶头，如单链可变片段（scFv）、跨膜，锚定受体在细胞表面上、并将scFv投射到细胞外空间的铰链域，以及抗原接合上触发的胞内信号域（图1A）。
抗原结合域
CAR的抗原特异性最经常由scFv模块（mAb的最小功能域）赋予，其中仅包含通过柔性连接器熔融的轻链和重链的可变区。
使用scFv作为CAR-抗原结合域的优点包括它们的高特异性，事实上，它们可以通过建立良好的方法，容易生产出来应对大多数抗原，并且它们可以容易地嫁接到CAR设计中。
而使用scFv结合结构域的缺点是它们低聚反应的趋势，这可能导致强直信号和T细胞衰竭。
替代结合域已被用于临床前研究中，包括受体、配体、细胞因子、DARPins、adnectins、Fc受体片段、纳米体、肽和可变淋巴细胞受体。
这些替代粘合剂的相对有效性、安全性和免疫原性尚未被充分研究，是现时工作的焦点。
CAR将强激活信号转导到T细胞的能力受到许多因素的影响，包括与抗原的结合亲和力、表达水平、靶细胞上的抗原密度和表位接近度。
与mAbs相比，在CAR环境中,结合亲和力和功效之间的关系有更细微的差异，其中更高的亲和力通常是理想的。
例如，基于来自临床前研究的观察，与较低亲和变异体相比，来自高亲和力scFv（具有0.56 nM解离常数）的受体酪氨酸类激酶孤儿受体1导致治疗指数增加。
然而，由于低抗原表达的肿瘤细胞的出现，这种方法可能会增加免疫逃避的风险。
其他因素，如靶抗原结合位点与细胞表面的接近，对裂解活性和细胞因子产生也有强烈的影响，在某些情况下取代了亲和力的影响。
在CD22-CAR环境中，两个靶向相同表位但具有不同亲和力的scFVs进行比较，没有揭示亲和力对CAR功能有显著影响，而具有较低亲和力的替代CD22结合剂（M971）证明最有效，可能是因为靶抗原表位具有更好的可访问性。因此，对于靶细胞上给定的抗原密度，可能存在特异性和有效的抗肿瘤应答所需的scFv亲和力的最佳范围和CAR表达水平。
共刺激结构域
共刺激结构域的选择影响T细胞的表型和代谢特征。
例如，CD28共刺激产生一种强效、但短命的效应器表型，有高水平的细胞溶解能力、白细胞介素-2（IL-2）分泌和糖酵解。
铰链和跨膜结构域
柔性铰链域是提供构象自由度，以促进与肿瘤细胞上的靶抗原结合的短肽片段。它可以单独使用，或与将T细胞表面的scFv隔开的间隔体域结合使用。
间隔物的最佳长度取决于结合表位与细胞表面的接近程度，具有需要较长间隔物的近端表位和需要较短的表位的远端表位。
除了促进CAR与靶抗原的结合，实现T细胞与癌细胞之间的最佳距离也有助于立体地阻断来自免疫突触的大抑制分子。
一些具有CH2CH3结构域长间隔物的CAR, 尽管在体外具有有效的效应功能，但其在体内的效力和持久性下降，这是由巨噬细胞、单核细胞和自然杀伤细胞上表达的Fc受体的结合所导致的差异。
CH2CH3残留物的删除和突变，显著改善小鼠模型体内的持久性和效力。
跨膜结构域的性质尚未被仔细研究，但它们可能会影响CAR的表达和内源性膜蛋白的结合。
提高安全性
临床试验报告了CAR-T相关毒性，如细胞因子释放综合征（CRS）、神经毒性、肿瘤效应和急性呼吸窘迫综合征，这些都是潜在的、致命的。
控制开关
控制严重的T细胞毒性的一种策略是通过自杀开关快速消融移植细胞（图2）。
例如，可以通过添加小分子药物，杀死表达可诱导半胱天冬酶caspase 9（iCasp9）的细胞，该小分子药物二聚化、并激活蛋白质，以诱导细胞程序性死亡。
在接受造血干细胞移植的患者中，该系统在30分钟内消除90%表达iCasp9的T细胞，并逆转移植物抗宿主病（GVHD）。
替代的自杀基因包括表位附加，由FDA批准的单克隆抗体治疗（如西妥昔单抗或利妥昔单抗）识别，通过内源性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性，诱导T细胞死亡。
自杀开关在阻止工程细胞的毒性方面是有效的，但却导致治疗的不可逆终止。
做为一种选择，非细胞毒性可逆系统可用于控制不良毒性而不删除治疗细胞。
例如，可以将CAR基因置于诱导表达系统的控制下，通过小分子如强力霉素和四环素来让CAR转录在ON和OFF状态之间切换。
这些安全机制可能具有局限性，例如相对较慢的诱导或受体表达减少，并且即使在没有诱导剂的情况下，系统的固有泄漏也可能导致残余的CAR表达。
模块化和可切换的CAR（sCAR）设计，其中特异性由可溶性抗原结合片段（Fab）确定，由sCAR工程细胞并行管理，增加了重要的安全性和特异性功能（图3B）。
在这个设计中，Fab充当桥接T细胞和TAA表达细胞的适配器。
这些方法目前只在临床试验，但临床前的结果表明，CAR活性和特异性可以根据桥联抗原结合分子的类型和剂量来调节，这可以提供一种手段,以安全目的来限制CAR的活动性，靶向多个抗原，从而阻碍抗原逃逸。
组合抗原检测
理想的肿瘤抗原仅由肿瘤细胞表达而非正常组织。针对这些抗原的基于T-细胞的治疗具有潜在的自身免疫效应。
为了减轻这些效应和提高特异性，一种策略是需要多个TAAS参与全T细胞活化（图4A）。
应用这一策略的系统，采用合成缺口受体（synNotch），受体结合抗原“A”释放转录因子，这反过来又驱动了抗原B’的CAR特异性表达。
这些“与门”T细胞能够清除在异种移植小鼠肿瘤模型中同时含有两种抗原的肿瘤，同时保留仅表达一种抗原的细胞。
然而，一旦synNotch诱导第二个CAR表达，该表达持续一段时间；因此，这样的细胞可以遍及全身，并随后与表达抗原B的正常组织反应。
尽管在小鼠模型中未观察到这种类型的毒性，但这是短期实验，不能完全复制人类长期T细胞的影响。
通过抑制健康抗原存在时T细胞应答的抑制性抗体（iCAR）的共同表达，CAR可以用来区分癌症和健康细胞（图4B）。
图4，逻辑门。
虽然靶向TAAs表达在正常组织也有自身免疫效应，来自临床前模型的证据表明，CAR-T细胞可能对健康组织中的低水平抗原表达没有反应。
自主传感与激活
CAR安全模块也可以被设计为通过在肿瘤部位激活CAR-T细胞,来实现靶向的空间控制。
用一种抑制肽，通过可裂解连接体在细胞外结合，伪装后的CAR可以实现这个目的，可逆地阻断scFv，并保持T细胞处于关闭状态，直到它们到达肿瘤微环境来实现这一目的。
一旦在那里，特异性分泌的蛋白酶局部切割抑制肽，并去掉CAR的伪装，使其靶向肿瘤细胞。
如果CAR疗法被广泛应用，CAR-T技术的进一步发展需要解决潜在的毒性。用CD19-CAR观察到的自身免疫效应，导致健康B细胞的死亡，通常是很耐受的，并且可以用静脉注射免疫球蛋白治疗来管理。
然而，当在实体肿瘤中靶向TAAS时，这些效应可能是有害的，因为这些大多数在基本组织上也表达。
一些细胞工程策略提供了可能的手段，在体内提高特异性和控制基本的CAR-T功能。未来的发展可以包括自主的反馈回路和控制机制，使工程T细胞能够连续地感知局部微环境中的关键生化线索，
并相应地调整它们的响应。例如，通过编程一个CAR-T细胞，当炎症细胞因子超过特定阈值时，分泌蛋白质来中和CRS相关的细胞因子的效应。
提高疗效，克服免疫抑制
归巢与输送
为了离开血管并积聚在实体肿瘤内，循环的T细胞必须进行外渗，这是由诸如粘附分子、趋化因子和趋化因子受体等一系列因素介导的高度协调的过程。
然而，肿瘤脉管系统具有放松的趋化因子谱，并下调关键粘附分子，如细胞间粘附分子1（ICAM-1）。
此外，天然T细胞可能不能表达适当的趋化因子受体，使其未能进入特定的肿瘤组织，导致归巢不良，并打开肿瘤免疫逃避的大门。
克服这种缺陷的一种策略是，设计T细胞表达趋化因子受体，如CCR2，CCR4和CXCR1。
扩张与坚持
在输送到肿瘤部位并遇到它们的同源抗原后，T细胞必须进行快速扩增，以获得相对于肿瘤负担的适当数量。
临床前研究表明，分泌IL-12、IL-15、IL-18和IL-21的T细胞有助于促进细胞增殖和重塑肿瘤微环境。
靶向肿瘤基质和支持细胞
已经证实，实体肿瘤强迫非转化的基质和免疫细胞，如髓源性抑制细胞（MDSC）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、癌相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤内皮细胞（TECs）和调节性T细胞（Treg），以维持肿瘤。这些条件细胞可以直接抑制肿瘤微环境中的CAR介导的抗肿瘤效应。靶向支持细胞可以有助于促进淋巴细胞浸润，并可能削弱肿瘤微环境的免疫抑制屏障。
肿瘤微环境中的免疫抑制
肿瘤细胞，连同肿瘤相关基质细胞，通过一系列免疫抑制信号，如转化生长因子-β（TGF-β）、IL-10和Fas配体，抑制T细胞功能。
肿瘤细胞还可以通过表达它们的配体来激活T细胞上的免疫检查点受体，如受体PD-1和CTLA-4。
免疫检查点是衰减T细胞活化的生理机制的一部分。通过使用单克隆抗体阻断免疫检查点受体的激活，重新激活被称为检查点阻断的T细胞的策略，最近已成为几种癌症的有效免疫疗法。
CAR-T治疗与检查点阻断相结合的临床前研究已经显示出协同效应，并且最近的临床报告表明，抗PD-1药物增强了CD19-CAR-T治疗对难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤和急性淋巴母细胞白血病的疗效。
通过靶向核酸酶选择性地敲除内源性基因，可以应用于预防肿瘤来源的免疫抑制。
代谢与抑制
活化后，T细胞必须适应它们的代谢，以满足与快速增殖和效应器功能相关的能量需求，例如细胞因子和细胞毒性有效载荷的产生。
肿瘤微环境中的异常代谢环境，由于肿瘤细胞和功能失调的肿瘤血管系统的高代谢活性，是低氧和酸性的，营养素如葡萄糖和谷氨酰胺耗尽，缺乏关键的氨基酸，如精氨酸和色氨酸。
这种不利的环境抑制T细胞效应器功能并促进有缺陷的T细胞状态。通过基因编辑代谢重组T细胞可以潜在地帮助它们抵抗这些环境条件。
CAR共刺激域的选择也可以驱动T细胞朝向不同的代谢谱。
用双特异性抗体避免抗原逃逸
以抗原逃逸的形式观察到了抗CAR-T治疗，这是一个通过选择抗原阴性细胞或通过谱系开关，下调或突变CAR的靶抗原，肿瘤逃逸CAR靶向的过程。
在实体肿瘤的环境下，抗原逃逸构成了潜在的更大的挑战，因为它们在抗原表达的广泛异质性。
最近的十例胶质母细胞瘤患者接受外部注入EGFR变体III（EGFRVIII）特异性CAR-T细胞治疗，7例接受治疗后肿瘤切除的患者中，5例EGFRVIII在肿瘤组织中的表达减少。
EGFRVIII抗原逃逸也被认为是肽疫苗的抗性机制。
双特异性抗体有可能通过同时靶向两种抗原来减轻这种逃逸机制（图4C）。
Tandem双特异性CARS可以通过串联两个scFv结构域来构建，这些构建可能需要优化重链和轻链的取向，以实现正确的配对和有利的构象结合，靶向每个抗原所需的连接长度要认真考虑。
对于靶向CD19和CD20的双特异性CAR，研究发现CD19近端和CD20远端scFv结构是理想的，因为这些抗原分别需要短和长间隔物；
在这种形式中，CD19 scFv是有效的连接物，让CD20 scFv远离表面。
多抗原CAR疗法的替代形式涉及在同一细胞中使用核糖体跳跃序列共同表达两种或多种不同特异性的CAR，或用混合的CAR-T细胞群体治疗。
值得注意的是，两个全长CAR的双重表达大大增加了递送到细胞的遗传有效载荷，而添加额外的scFv模块对有效载荷只有很小的影响。
由杀死肿瘤细胞的CAR-T细胞诱导的免疫应答，通过诱导“表位扩散”，在防止抗原丢失变体的上升中扮演重要角色，这是在炎性环境中的肿瘤细胞裂解导致额外的肿瘤抗原呈现时发生的。
癌症免疫治疗的另一种方法是基于使用T细胞作为载体向肿瘤部位递送治疗剂。
T细胞被设计成分泌疱疹病毒进入介质HVEM的可溶性形式，通过B和T淋巴细胞衰减器信号轴抑制B细胞淋巴瘤增殖增强了CD19-CAR-T治疗的疗效。
microRNA（miRNA）是改善CAR-T治疗的另一个有吸引力的靶点，因为这些非编码RNA参与了T细胞发育和效应器功能的生理调节。
生物材料和药物递送的进步为提高转移细胞的功效提供了有前途的替代途径。
T细胞可以配备纳米凝胶或脂质体“背包”加载治疗剂，如TGF-β抑制剂或IL-15，赋予治疗具有限时释放功能。
这些贮库制剂的释放特性可以通过化学手段微调，甚至被配置为通过穿孔素介导的颗粒破裂，在细胞溶解过程中卸载。
T细胞也可以被加载到生物聚合物，连同佐剂，并直接植入实体瘤。这种方法中，从死亡细胞和佐剂的碎片的组合促进直接免疫细胞在肿瘤部位的活化。
参考文献
Programming CAR-T cells to kill cancer
Louai Labanieh, Robbie G. Majzner & Crystal L. Mackal
相关阅读