逆转录PCR、RT-PCR实验从入门到精通
如何进行RT-PCR实验？今天美格君邀请了Jones博士就这个议题，与大家一起探讨。
一、本次RT-PCR实验目的
学习和掌握逆转录、RT-PCR基因扩增技术和操作方法，并深刻理解逆转录、RT-PCR基因扩增技术在功能基因克隆与载体构建过程中的重要性。
二、RT-PCR实验试剂和材料
大肠杆菌DH5a、Trizol试剂、逆转录试剂、PCR相关试剂、PCR产物克隆试剂、氯仿、异丙醇、DEPC水等。
三、实验器材
PCR仪、移液枪、台式低温离心机、恒温水浴锅、恒温培养箱、电泳仪、研钵、紫外分光光度计、移液器和吸头、硅烷化的PCR小管、DNA扩增仪、琼脂糖凝胶电泳所需设备(例如：电泳槽、电泳仪) 、一次性手套。
四、逆转录RT-PCR实验原理
什么是PCR技术？
PCR，polymerasechain reaction，即聚合酶链反应链技术，PCR技术利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性，这个循环操作可以在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍。
PCR技术的特点
1. 高度特异性
2. 高度敏感性
3. 操作简便
4. 适用广泛
PCR三个过程
变性: 通过加热, 使DNA双螺旋的氢键断裂, 双链解离形成单链DNA。
退火: 当温度突然降低时, 反应体系中的引物和其互补的DNA（cDNA）模板在局部形成杂交链。
延伸: 在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸dATP、dCTP、 dTTP、dGTP，以及Mg 2+存在的条件下, 聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。
图. PCR反应原理
PCR反应体系构成
| 成分 | 用量 |
| 上下游引物 | 10-50pmol |
| 缓冲液buffer | pH 8.3 |
| Mg2+ | 0.5-2.5mM |
| dNTPs | 0.2mM |
| Taq DNA聚合酶 | 2.5U |
| DNA模板 | 1ng |
PCR反应循环的主要参数
预变性: 92℃-95℃, 2-5分钟
变 性: 92℃-95℃, 30秒-1分钟
复 性: 40℃-60℃, 20秒--2分钟
延 伸: 70℃-75℃, 30秒--3分钟
循 环: 30-40次
总延伸: 72℃, 7分钟
PCR引物设计原理
PCR引物长度在15-30bp, GC含量在45-55%之间。
Tm=4(G+C)+2(A+T)
3'端不能与引物内部互补, 以免形成二级结构。两个引物各自的3'端不能互补,以免形成自身扩增。引物必须经过GenBank查询, 证实没有与其他非目的DNA有高度互补以后, 才能使用。
PCR用途
PCR主要用途包括:
1.目的基因的克隆：
利用特异性引物克隆；利用简并引物克隆
2.基因的体外突变：
采用随意设计的引物, 在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造
3.基因表达分析
4.DNA的微量分析检测：
个人识别，亲子鉴定
逆转录PCR, 又称RT-PCR
RT- PCR, ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction, 即逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
RT-PCR原理
RT-PCR提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物, 利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板, 进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。
首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
RT-PCR用途
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。RT-PCR技术灵敏，而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
图. RT-PCR原因原理图
第一链合成
如何选择反转录酶
1、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2、禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3、Thermusthermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4、MMLV反转录酶的RNase H突变体：商品名为SuperScript 、SuperScriptⅡ、Magigen MagicScript II、MagicScrpt III。此种酶较其它酶能将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
四、RT-PCR实验步骤
1、RNA的逆转录
A. 用1.5ml的离心管混匀下列试剂(TaKaRa公司):
| 材料 | 用量 |
| OligodT prime 50uM | 1μl |
| dNTP 10mM | 1μl |
| total RNA | 2-3ug |
| DEPC水 | Up to 10μl |
B. 在PCR仪进行下列条件的变性, 退火反应
65 ℃ 5分钟, 冰上急冷
C. 在上述管中配制下列反转录反应液(Magigen, NEB):
| 材料 | 用量 |
| 5×First Strand buffer | 4μl |
| Rasin(40 unit/ ml) | 0.5μl |
| PrimeScript Rtase (200U/μl) | 1μl |
| RNase Free dH2O | 4.5μl |
| Total | 20μl |
D.将管子置于42℃水浴中反应1小时。1小时后，在70℃反应10-15分钟，终止反应。放置在-20℃冰箱中保存。
2、PCR
以逆转录的cDNA为模板，用目的基因引物进行PCR。PCR扩增体系为：
| 成分 | 用量 |
| cDNA | 2μl |
| 10X PCR buffer | 5μl |
| dNTP (2.5mM) | 2μl |
| primer1 | 0.5μl |
| primer2 | 0.5μl |
| Taq酶 | 0.5U |
| ddH2O | 补足到50μl |
扩增条件以引物特性而定。
PCR条件：
94℃变性5分钟后开始以下循环
• 94℃变性反应50秒
• 58℃退火反应50秒
• 72℃延伸反应1分钟
• 进行24个循环
• 最后72℃反应7分钟
• 4 ℃冷却恒定。
3、电泳检测PCR产物
采用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量（取10μl扩增产物） 、引物扩增的特异性及长度 。并可根据标准DNA的量，粗略计算 PCR产物的总量。本次实验PCR产物长度：
Os L29-m-PCR( A):340bp:
引物序列L29-m :
up: 5’-TgCgTgTTCgCgCCCTACTT-3’;
low:-5’-gCCACCTgCGTCTTCgCCTg-3’
GCCACCTGCGTCTTCGCCTGCGCCACCTGCACCTGCAGCGTCGCCAGCTGCGGCATCCGTGTGCTAAGT
TAGCTCGCCGGCGAGTGATCGATCGATCGCGAGGGGTTTAAGAATTTGTAATTACCTGCTGCTGCAGCG
CGAAGATGTGGGCGACGCAGCCGTAGACGGGGTCGCGCAGCCTGGCCTGCGCCTCGTAGGTGACGGT
GGCGGCGACCTCGCTCCGGTCGCCCGGCGCCACCTGCTGCAGCAGCTTCGCCGCGTTGCTGGCGCCGA
ACACCTTGTGTATCGCCGCGAACTGCGCCGCCCCGTCCTCCGCGCAGAAGTAGGGCGCGAACACGCA
是 Os L29基因ORF中间一段, 可用于RNAi载体构建
L29-PCR( D) :550bp
引物序列L29 :
up:- 5’- gctgccaatggcgtcgtcggg-3’;
low:-5’-TCATTCCTCCTgCTCgCCgAA-3’
TCATTCCTCCTGCTCGCCGAAGCAGTACATGTCCTGCAGCGACGTCGACCCGTCGGAGCGCGGCGCGC
TGTAGCAGCCGGAGCTCTGCGTCGAGGTCATCGTCGACTCGTGCTCAATCTGCCACGCCTGCTGCTGCT
GCTGCTGATGCTGAAGGAGAGGGTTCCCAGCCGTCAGCATGCCGGCCGCCGCCAGCGTCTGCGCCACC
TGCGTCTTCGCCTGCGCCACCTGCACCTGCAGCGTCGCCAGCTGCTGCTGCAGCGCGAAGATGTGGGC
GACGCAGCCGTAGACGGGGTCGCGCAGCCTGGCCTGCGCCTCGTAGGTGACGGTGGCGGCGACCTCG
CTCCGGTCGCCCGGCGCCACCTGCTGCAGCAGCTTCGCCGCGTTGCTGGCGCCGAACACCTTGTGTATC
GCCACGAACTGCGCCGCCCCGTCCTCCGCGCAGAAGTAGGGCGCGAACACGCACTCCGCCGCGCACTT
GCGCCGCAGGAACTTGCACGCCCCGCACGGCGACCCCGGCACGCCGCCCACTCCCGACGACGCCATTG
GCAGC
PCR实验注意事项：
1.PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
2.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。
3.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
4.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
5.PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的产量。
实验后应该思考的问题和经验总结：
1. 降低退火温度对反应有何影响?
2. 延长变性时间对反应有何影响?
3. 循环次数是否越多越好?为何?
4. 如果出现非特异性带, 可能有哪些原因?
建议大家先思考，再参考后面的经验总结。
实验结果
Dl2000
PCR经验总结：
1. 降低退火温度对反应有何影响?
退火温度越高，断开氢键的热能越大，引物与模板越不易结合。反之，退火温度越低，越容易形成氢键，进行退火。 所以当温度高时，只有碱基匹配程度高的，也就是模板与引物形成配对数越多的引物，才能结合到模板上，这样扩增出来的条带最少，甚至只有一条，也就是引物和目的序列的完美匹配，因此特异性越高。反之，若退火温度低，引物和模板匹配低时，也能稳定存在，那么模板上可能存在很多区域能和引物上的少量碱基匹配，进行引发，因此dna条带会很多，非特异带增加。 特异带是指你的目的带。非特异带是pcr中扩增出的非目的带。退火是指温度下降，单链DNA与引物结合的过程。温度过低，可造成引物与模板之间只需有一小段可以互补配对就能配对，造成非特异性产物增加。而温度高时，需要引物与模版之间有较长的互补配对序列才能相互配对，特异性增强。
2. 延长变性时间对反应有何影响?
变性时间延长会导致酶活性的降低。
3. 循环次数是否越多越好?为什么?
虽然，在一定范围内，随着反应循环次数的增加，产物会增多；但超过了一定的次数就不好了。因为再次循环都有高温到低的温度变化，聚合酶的活性有限，而且一般体系中引物和原料的量也不会是无限供应的。随着反应的进行，酶会逐渐失活、dNTP等原料会逐渐消耗掉。
另外循环次数过多，产物间可能会形成较为复杂的结构，影响其作为模板的效率，因此循环次数不是越多越好，一般PCR反应的循环不超过35次。一般设置30-35个循环是比较合适的。
4. 如果出现非特异性带, 可能有哪些原因?
造成非特异性带的原因可能有：
1)、引物设计不合理，出现发夹结构或二聚体；
2)、退火温度不合适；
3)、聚合酶质量不好；
4)、有污染；
5)、引物不纯或过量；
6)、模板过量。
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