摘要

Bst DNA聚合酶大片段是一种常用的DNA聚合酶，具有高保真、耐高温等独特的特点，能引发链置换反应，是一种重要的DNA多重置换扩增酶。

实验目的

设计一种成本低、产量高、扩增活性高的Bst DNA聚合酶大片段表达体系;

探究该Bst酶应用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA扩增条件。

实验方法

采用pTWIN1质粒作为载体克隆表达Bst DNA聚合酶大片段，应用几丁质亲和层析柱纯化该酶，使用该酶对人类基因组DNA进行不同温度下的扩增，探究其最适反应温度，并据此对胃癌石蜡包埋组织基因组DNA进行扩增。

结果

由此得到的Bst DNA聚合酶大片段能运用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA扩增，扩增效率可达 200倍，并能应用于aCGH 芯片。

结论

扩增得到覆盖基因组范围大、保真性高的DNA扩增产物。 该应用与aCGH结合，可以对少量的癌症石蜡包埋组织DNA样本进行全基因组扩增，让其基因拷贝数变异研究成为可能。

近年来人们对多种肿瘤基因特性、以及基因组检测的有效性日益关注。然而基因组分析的广泛应用却受到从生物样本中得到的基因组DNA 总量的限制。 利用甲醛固定和石蜡包埋的方法，可以保存人类组织样本的绝大部分形态。这一方法已经被使用了几十年。 我们需要建立一种针对从石蜡包埋组织中提取的DNA进行全基因组扩增的方法。

目前已经开发、并逐渐成熟和完善的全基因组扩增方法主要有两种:

1. 聚合酶链反应PCR技术， polymerase chain reaction，

2. 等温扩增技术，isothermal amplification^［1］。

PCR技术种类

PCR技术主要包括简并寡核苷酸引物PCR( degenerate oligonucleotide primed-polymerase chainreaction， DOP-PCR )^［2］;

引物延伸预扩增 (primer extension preamplification，PEP) ^［3］;

标记PCR (Tagged-PCＲ， T-PCＲ)^［4］;

单细胞比较基因组杂交SCOMP ( single cell comparative genomic hybridization，SCOMP) ，即衔接头PCR(linker adaptor-PCＲ)^［5-6］。

这些PCR方法都依赖于高质量和高精度的热循环仪。而且，使用随机引物，以增加与模板的结合位点。这些PCR技术的区别在于，不同的引物设计和温度变化。 这些方法可将模板扩增几百倍，产物大小为200～3000bp。

PCR技术的缺点

但是，由于容易发生非特异性扩增、位点覆盖不完全、DNA产物片段小于1kb等缺点(例如：DOP-PCＲ更倾向于扩增短的等位基因^［2］，SCOMP扩增倍数和精确度也各不相同) ，限制了这些方法的应用^［7］。

等温扩增技术

等温扩增技术即超支化链置换扩增技术( hyperbranched strand displacement amplification，HSDA) ，也就是人们熟知的多重置换扩增 ( multiple displacementamplification，MDA)^［5,8］。 MDA基于两个要素^［5,9-10］: 引发链置换反应的酶的能力和复制过程中随机引物产生的随机起始位点。某些DNA聚合酶在延伸新链的过程中，如果遇到下游DNA链，可以继续延伸反应，并同时将下游双链剥离，产生游离的单链，这种反应称为链置换反应^［11］。

目前发现三种酶能够在MDA 中起到催化作用:

1. Ф29 DNA聚合酶、

2. 嗜热脂肪芽孢杆菌( Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶大片段( Bst DNA polymerase，large fragment)

3. Klenow片段。

扩增原理

反应启动时，基因组模板变性成为单链，体系中大量的随机引物在多 个位点与其进行退火结合，然后在Bst DNA聚合酶大片段的作用下，进行延伸; 新合成出的DNA链可将下游的模板互补链置换掉，被置换的单链又作为新的模板，与随机引物退火结合并，进行新的DNA合成。 随着越来越多的DNA新链产生，越来越多的随机引物与之退火结合，逐渐形成呈分支放射状的网络样DNA产物，包含模板DNA的数千、乃至数百万拷贝^［9］，如图1^［12］所示。 它是近几年迅速发展起来的一种全基因组扩增( whole genome amplification，WGA) 技术，WGA技术。一些研究者^［8-10］的工作表明，使用 Bst DNA 聚合酶大片段对从新鲜或者冷冻组织中提取的完整 DNA进行MDA，能够使其产生稳定、 均匀的扩增，且扩增后不会失真。

图 1 Bst酶多重置换扩增原理图

Fig． 1 Multipledisplacement amplification

Bst DNA聚合酶大片段的特性

Bst DNA 聚合酶大片段是嗜热脂肪芽孢杆菌( Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶的一部分，具有 5'～3' 端DNA聚合酶活性，但不具有3'～5' 端外切核酸酶活性。 因其本身无3'～5'端外切核酸酶活性，在测序反应中不会对反应造成停顿，并且兼具极好的条带均一性和高保真性，能够有效解开测序模板的二级结构，提高测序的准确度^［13-14］。鉴于Bst DNA聚合酶大片段以上的特点和其所具有的链置换反应活性，本研究将Bst酶应用于癌症石蜡包埋组织中基因组DNA的扩增，并将扩增产物用于本实验室制备好的胃癌微阵列比较基因组杂交芯片aCGH (array comparative genomic hybridization，aCGH) 研究中。但鉴于其高昂的价格不利于大量MAD和基因组分析研究的发展，本实验室独立克隆、表达和纯化该Bst酶用于后续研究。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种与载体

        本实验室所用主要菌种有Geobacillusstearothermophilus ( Donk ) ( ATCC 29609), 及大肠杆菌 ( Escherichia coli) 10β、 E.coli ER2566 等，所用主要质粒载体为 pTWIN1 ( N6951 ) ，购自美国NEB公司。

1.1.2 酶和化学试剂

       人类基因组由本实验室提供;

       限制性内切核酸酶、T4 DNA连接酶等购自Thermo Scientific 公司;

       Bst DNA polymeraselarge fragment、 几丁质亲和层析柱购自NEB公司;

       250bp DNA Ladder、 λ-Hind Ⅲ digest DNAMarker 购自 TaKaRa公司;

       广谱蛋白Marker 购自北京康为世纪生物科技有限公司;

       其他试剂药品均采用国产分析纯化。

1.2 仪器和设备

实验所用主要仪器包括PCＲ仪( 南京赛飞生物科技有限公司) ，电泳仪( Bio-Ｒad 公司)全自动凝胶成像分析仪 JS-680B( 上海培清科技有限公司) ，分子杂交箱Mini Oven MKII( Thermo ScientificHybaid，美国) ，分子杂交 仪 FYY-4 ( 兴化市分析仪器厂) ，分光光度计Nanodrop 2000( Thermo Scientific，美国) ，荧光光度计TKO100( Hoefer Scientific 公司，美国) ，微阵列芯片扫读仪 Gene Pix 4000A( Axon 公司，美国) 。

2 方 法

2.1 Bst DNA 聚合酶大片段的克隆、表达与纯化

      以Bacillus stearothermophilus DNA polymerase I( polA) gene GenBank:U33536的基因组作为模板设计引物，长度为2631bp。 根据其DNA序列和所采用的表达载体pTWIN1 ( N6951 ) 的具体情况设计引物。Bst DNA聚合酶大片段序列为868 ～ 2631bp^［15］ ，故对此1764bp左右的片段进行引物设计。 以嗜热脂肪芽孢杆菌染色体DNA为模板，进行PCＲ反应，以此获得 Bst DNA聚合酶大片段蛋白 质的完整基因; 将其重组到pTWIN1质粒中，形成表达质粒pTWIN1-LF( LF 表示Bst DNA聚合酶大片段的基因片段) ，并将其转化到宿主菌 E． coli ER2566 中; 然后将含有表达质粒pTWIN1-LF的E． coli ER2566 接种于100ml 含有100mg/L 氨苄青霉素的LB 液体培养基中，于 37℃ 、200r/min 振荡培养至A₆₀₀ 为 0. 3 ～ 0.5。 加入 IPTG( 1mol/L) 至终浓度为 0.1mmol/L; 再 20℃ 、200r/min 诱导培养12h。收集经诱导表达的大肠杆菌菌体，洗涤后重悬于裂解液 ( 20mmol/L Tris-HCl， pH 8.5， 500mmol/L NaCl， 20μmol/L PMSF) 中, 用酶法将菌体裂解，离心所得上清上样于几丁质亲和层析柱，过夜诱导自切，经洗脱缓冲液洗脱、收集、浓缩，最终获得纯化了的Bst DNA聚合酶大片段溶液。 使用超滤管对该蛋白质进行脱盐置换缓冲液，最终将蛋白保存于缓冲液( 10mmol/L Tris- HCl， 50mmol/L KCl，1mmol/L DTT，0.1mmol/L EDTA，0.1% Triton X-100，50%甘油，pH7.1) 后置于－20 ℃保存。

2.2 Bst DNA聚合酶大片段扩增活性及最适温度测定

     取0.2μg人类基因组DNA ( 512ng/μl)，加 入ddH₂O至60μl，将溶液置于100℃ ，5分钟; 加入40μl 2.5 × Bst Mix( 随机引物 dN9 600ng， 2.5mmol/L dNTP，10 × Bst Buffer) ，将混合溶液置于 4℃ ，30分钟; 加入5μl Bst DNA聚合酶大片段，45℃ 反应3h; 检测 DNA 浓度。并在35～65℃设置温度梯度，探究其最适温度。

2.3 癌症石蜡包埋组织基因组DNA的提取

      方法步骤参考袁亚婷等^[16]二甲苯脱蜡-酚氯仿法从胃癌样本1和2石蜡包埋组织中提取 DNA，但略有改动。

2.4 Bst DNA聚合酶大片段应用于癌症石蜡包埋组织DNA基因组扩增

     用 Bst DNA聚合酶大片段对胃癌样本1和样本2石蜡包埋组织DNA进行扩增，每组设置三个平行对照，扩增方法同 2.2。

2.5 将扩增产物应用于胃癌aCGH芯片

      将 2.4 中的胃癌样本基因组扩增产物和正常人类基因组扩增产物, 用荧光染料Cy3和Cy5分别标记，并运用荧光交换标记法( dye-swap labeled) ，即用 Cy5 标记同样的胃癌样本基因组扩增产物，用 Cy3 标记同样的正常人类基因组扩增产物，充分混合后，两组标记好的产物与本实验室制备好的胃癌aCGH芯片进行杂交。用微阵列芯片扫读仪对杂交后的芯片进行扫读。

3 扩增结果

3.1 PCＲ反应

     反应得到Bst DNA聚合酶大片段基因经1% 琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所 示，目的基因长度大约1764bp，与电泳结果吻合。

3.2 SDS-PAGE凝胶电泳

    Bst DNA聚合酶大片段的蛋白质经几丁质亲和层析柱纯化后，进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图3 所示: 目的蛋白大小约 67kDa，与电泳结果吻合。

3.3 Bst DNA 聚合酶大片段扩增活性及最适温度测定

3.3.1 Bst聚合酶的片段扩增

      以人类基因组为模板，分别用NEB的Bst DNA polymerase large fragment 和自产的Bst DNA聚合酶大片段对其进行扩增，设置三组平行实验，并设置以ddH₂O 代替酶的空白对照，3h 后，用荧光光度计检测各管DNA浓度，结果如表1所示。下图显示了Bst酶扩增结果。

图 2 Bst DNA聚合酶大片段基因PCR产物

Fig.2   PCＲ products of Bst DNA polymerase large fragment gene

参数：

M: 250bp DNA ladder;

1: Bst DNA polymerase large fragment gene

图3 纯化后的Bst DNA 聚合酶大片段

Fig.3   Purificationof the Bst DNA polymerase large fragment

参数：

MW: Broad spectrum protein marker;

1: Bst DNA polymerase large fragment

表 1 不同酶扩增后产物浓度(ng/μl)

Table 1 Product concentration afteramplified by different enzymes ( ng/μl)

对扩增后产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，结果如图4 所示。

图 4 人类基因组扩增产物

Fig.4   Amplification products of human genome

参数：

M: λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker;

1: HumanGenome;

2: NEB Bst DNA polymerase large fragment;

3: Post-purification Bst DNA polymeraselarge fragment;

4: Negative control

3.3.2 不同温度下的基因组的扩增

        以人类基因组为模板，dN9 为引物，用Bst DNA聚合酶大片段对其在25℃ 、35℃ 、45℃ 、55℃ 、65℃ 分别进行扩增，3h 后用荧光光度计检测各管 DNA浓度，结果如表 2 所示。

表2 不同温度下扩增产物浓度(ng/μl)

Table 2 Concentration of the amplification productsat different temperatures ( ng/μl)

向每个反应体系中各加入1/10体积的5mmol/L NaCl 和等体积的异丙醇，－ 20℃ 放置10分钟后，14000r/分钟离心6分钟，将扩增产物沉淀下来，并重新溶解于 50μl 1 × TE溶液中。用Thermo Nanodrop 2000 检测各扩增产物的浓度，结果如表3 所示。

表3 不同温度扩增产物浓度( ng/μl)

Table 3 Concentration of the amplification products at different temperatures ( ng/μl)

将上述扩增产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，结果如图 5 所示。

图5 不同温度下人类基因组扩增产物

Fig． 5Amplification products of human genome at different temperatures

参数：

M: λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker;

1: 25℃ ; 2: 35℃; 3: 45℃ ;4: 55℃ ; 5: 65℃

3.4 Bst DNA聚合酶大片段应用于癌症石蜡包埋组织DNA基因组扩增

     用 Thermo Nanodrop 2000 对所提取的胃癌样本1和2 的DNA进行浓度和纯度测定，结果如表 4 所示。

表 4 胃癌样本1和2 DNA的浓度( ng/μl)

Table 4 The concentration of the gastriccancer samples 1 and 2 DNA ( ng/μl)

使用 Bst DNA聚合酶大片段对所提取的胃癌石蜡包埋组织DNA基因组进行扩增，3h 后用荧光光度计检测各管DNA浓度，结果如表5所示。

表 5 胃癌样本 1 和 2 DNA 扩增产物浓度( ng/μl)

Table 5 Amplification products of thegastric cancer samples 1 and 2 DNA ( ng/μl)

将扩增产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示。

图 6 胃癌样本石蜡包埋组织DNA基因组扩增产物

Fig． 6Amplification products of the FFPE gastric cancer DNA

参数：

M: λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker;

1: Gastric cancersample 1 DNA;

2: Gastric cancer sample 2 DNA;

3:Amplification products of gastric cancer sample 1 DNA;

4:Amplification products of gastric cancer sample 2 DNA

3.5 扩增产物与胃癌aCGH基因芯片技术

      用微阵列芯片扫读仪对杂交好的胃癌 aCGH基因芯片进行扫读，该芯片中共有7488个探针点。 以样本1为例，样本1的DNA用Cy5 标记，对照为正常人类基因组用Cy3 标记，杂交后扫读结果如图7 所示。样本 1 DNA 用 Cy3 标记，对照为正常人类基因组用 Cy5 标记，杂交后扫读结果如图8 所示。选取两张扫读图片中第 1 行第 3 个探针区块放大，并对比显示如图 9 所示。

4 讨论

    实验结果显示，无论是正常人类基因组还是从胃癌石蜡切片组织提取的DNA，经过Bst DNA 聚合酶大片段扩增后，均可见显著扩增。 温度梯度实验结果显示，使用 dN9 随机引物进行扩增时，该Bst酶的最适温度为45℃ 。多次扩增结果显示，Bst DNA聚合酶大片段能够实现稳定扩增，平均扩增倍数能达到200 倍，扩增产物均匀性差别不大。 但是在500～2000bp 有显著扩增条带。与胃癌 aCGH芯片杂交结果显示，扫描得到图像中芯片上的探针点大部分呈现黄色，代表着 Cy3 与 Cy5激发出来的荧光强度基本相同，即样本与对照之间的拷贝数基本相同。这说明扩增产物能与整个芯片上的7488 个探针点进行杂交，并得到较为理想的结果。 同时，图9 中箭头指示的三个不同探针点呈现绿色和红色相反的结果，刚好符合荧光交换标记法的结果，其他探针区块的部分探针点也有相同的结果，绿色或者红色点代表着不同程度的拷贝数变异。这些更加印证了用Bst DNA 聚合酶大片段扩增后产物能够应用于aCGH研究中。

Aviel-Ｒonen 等人^［1］研究表明，从石蜡包埋组织中提取的DNA经过Bst DNA 聚合酶大片段扩增后，平均扩增倍数能达到 803 ～ 1035 倍。 这比之前报道的 Large等人^［9］从新鲜或者冷冻组织样品中提取的 DNA 扩增倍数为 250 倍要高很多。 这可能是因为不同的 DNA浓度测量方法导致的: 前者使用的是 NanoDrop 分光光度法，后者使用的是 PicoGreen DNA浓度测定法。 另一种可能的解释是 Bst DNA 聚合酶大片段会对短片段的DNA进行优先扩增^［17-18］。 并且使用实时定量PCR( quantitative realtime PCＲ，qPCＲ) 和aCGH 两种方法对未扩增的样本 DNA和扩增后产物进行拷贝数差异进行分析，结果显示扩增前后拷贝数差异基本相同，即扩增后不会失真。

本研究中所使用的 Bst DNA 聚合酶大片段具有高最适温度，能够适应更加苛刻和广泛的扩增条件; 同时Bst酶消除了 DNA二级结构，因而能够准确并且均匀地扩增全基因组序列。使用高度续进性的 BstDNA聚合酶大片 段得到长的DNA片段，确保了扩增得到的DNA覆盖了整个基因组，连贯并且无偏地扩增所有的遗传位点，从而能够应用于 aCGH 研究中，更加真实和准确地反应基因组中 DNA拷贝数变异情况。

大量研究结果表明，Bst DNA聚合酶大片段适用于对从石蜡组织中提取 DNA的WGA。扩增后产物 DNA可用于后续的 qPCR 和 aCGH方法来检测基因拷贝数变异。 该扩增方法效率高，技术成熟。 使用 BstDNA聚合酶大片段进行全基因组扩增将成为常规分子实验的一部分，随着 WGA技术的不断完善，它将会有更广泛的临床和科研应用前景。

图7   样品 1 Cy5 和对照 Cy3 杂交结果

Fig.7 Hybridization of sample 1 Cy5 and Human Genome DNA Cy3

图8 样品 1 Cy3 和对照 Cy5 杂交结果

Fig.8   Hybridization of sample 1 Cy3 and Human Genome DNA Cy5

图9 两张芯片杂交后第 1 行第 3 个探针区块

Fig． 9 Block 3 onrow 1 of the two hybridized chips

参考文献

［ 1 ］ Aviel-Ｒonen S， Zhu C， Coe BP， et al． Large fragment BstDNA polymerase for whole genome amplification of DNA from formalin-fixedparaffin-embedded tissues． BMC Genomics， 2006， 7( 1 ) :312．

［ 2］ Grant S F， Steinlicht S， Nentwich U， et al． SNP genotyping on a genome-wideamplified DOP-PCＲ template．Nucleic Acids Ｒes，2002， 30( 22) : e125．

［ 3］ Zhang L， Cui X， Schmitt K，et al． Whole genome amplification from a single cell:implications for genetic analysis． Proc Natl Acad SciUSA， 1992， 89( 13) : 5847-5851．

［ 4 ］ Grothues D， Cantor C Ｒ， Smith C L． PCＲ amplification of megabase DNA with tagged random primers (T-PCＲ) ． Nucleic Acids Ｒes， 1993， 21( 5) :1321-1322．

［ 5］ Dean F B， Hosono S， Fang L，et al． Comprehensive human genome amplification usingmultiple displacement amplification．Proc Natl Acad SciUSA， 2002， 99( 8) : 5261-5266．

［ 6 ］ Stoecklein NH， Erbersdobler A，Schmidt-Kittler O， et al．SCOMPis superior to degenerated oligonucleotide primed-polymerase chain reaction forglobal amplification of minute amounts of DNA from microdissected archivaltissue samples． Am J Pathol，2002， 161( 1) : 43-51．

［ 7］ Spits C， Le Caignec C， De ＲyckeM， et al． Optimization and evaluationof single-cell whole-genome multiple displacement amplification． Human Mutation， 2006， 27( 5) : 496-503．

［ 8］ Dean F B， Nelson J Ｒ， Giesler T L， et al． Ｒapid amplification of plasmid andphage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circleamplification． Genome Ｒes， 2001，11( 6) : 1095-1099．

［ 9］ Lage J M， Leamon J H， Pejovic T， et al． Whole genome analysis of geneticalterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacementamplification and array-CGH． Genome Ｒes，2003， 13( 2) :294-307．

［10］ Ｒook M S， Delach S M， Deyneko G， et al． Whole genome amplification of DNAfrom laser capture-microdissected tissue for high-throughput single nucleotidepolymorphism and short tandem repeat genotyping． Am JPathol， 2004， 164( 1) : 23-33．

［11］ 何艳，蒋涛． 基于链置换反应的 DNA 等温扩增技术应用 进展． 医学综述，2010，1: 24-27．He Y， JiangT． Application progress of DNA isothermal amplificationbased on strand displacement reaction． Medical Ｒecapitulate， 2010，1:24-27．

［12］ Lasken Ｒ S， Egholm M． Wholegenome amplification: abundant supplies of DNA from precious samples orclinical specimens．Trends in Biotechnology， 2003， 21( 12) : 531-535．

［13］ Mcclary J， Ye S Y， Hong G F，et al． Sequencing with the large fragment of DNApolymerase I from Bacillus stearothermophilus．DNA Seq， 1991， 1( 3) : 173-180．

［14］ Mead D A， Mcclary J A， Luckey J A， et al． Bst DNA polymerase permits rapidsequence analysis from nanogram amounts of template．Biotechniques， 1991， 11( 1) :76-78， 80， 82-87．

［15］ Phang S M， Teo C Y， Lo E， etal． Cloning and complete sequence of the DNA polymerase-encodinggene ( BstpolI) and characterisation of the Klenow-like fragment from Bacillus stearothermophilus． Gene， 1995， 163( 1): 65-68．

［16］ 袁亚婷，江岳鑫，尹小文，等． 四种石蜡包埋组织 DNA 提取方法的比较． 中国组织工程研究与临床康复，2010，24: 4430-4434．

Yuan Y T， Jiang Y X， Yin X W， et al．Comparison of four methods for DNA extraction from paraffin-embedded tissues．Journal of Clinical Ｒehabilitative TissueEngineering Ｒesearch，2010，24: 4430-4434．

［17］ Srinivasan M， Sedmak D， Jewell S．Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity ofnucleic acids． Am J Pathol，2002， 161( 6) : 1961-1971．

［18］ Siwoski A， Ishkanian A， Garnis C， et al． An efficient method for theassessment of DNA quality of archival microdissected specimens． Mod Pathol， 2002，15( 8) : 889-892．

文章参考

Bst DNA 聚合酶大片段在全基因组扩增中的应用

张心愿 邓佳 刘馨   陈琳   林峻   蔡伟文

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