CRISPR Cas9基因编辑原理、敲除机制
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来自塔夫茨大学的Cavanagh和Garrity教授在CRISPR Cas基因编辑方面有很高的造诣。
今天美格君就把Cavanagh和Garrity教授关于CRISPR Cas运行原理、敲除机制的文章整理了一下，大家一起聆听一下大牛们的讲解。
CRISPR Cas9基因编辑原理、敲除机制
CRISPR Cas基因编辑的关键步骤是选择性地靶向特定的DNA序列。CRISPR Cas9蛋白和引导RNA（gRNA）两种生物大分子相互作用形成一种复合物，可以有效的选择性地识别靶序列。
在天然和人工CRISPR/Cas系统中，CRISPR Cas9蛋白负责定位和切割靶DNA。Jinek等人研究发现CRISPR Cas9蛋白有六个结构域，REC I、REC II、Bridge Helix、PAM Interacting、HNH和RuvC（图1）。
RecⅠ结构域是最大的，负责与RNA结合。RECⅡ域的作用尚不清楚。富含精氨酸的Bridge Helix对于启动目标DNA结合时的切割活动至关重要。PAM Interacting域赋予PAM特异性，负责启动与靶DNA的结合。
HNH和RuvC结构域是切割单链DNA的核酸酶结构域。它们与其他蛋白质中发现的HNH和RuvC结构域高度同源。
图1. CRISPR Cas9蛋白结构域。CRISPR Cas9蛋白由六个结构域组成。晶体结构、图示来自PDB文件: 4CMP
如果没有向导RNA，CRISPR Cas9蛋白保持无活性。
在工程化的CRISPR Cas9系统中，向导RNA由单链RNA组成，形成由一个四碱基环tetraloop和两个或三个茎环stem loops组成的T形结构（图2）.向导RNA经过工程化后，具有与靶DNA序列互补的5'末端。
图2：工程化向导RNA。工程化向导RNA是单链RNA。它形成一个四碱基环和两个或三个茎环（本图显示了三个）。目标区域显示为红色。（图像来自PDB：4UN3 ）
这种人工向导RNA与CRISPR Cas9蛋白结合，结合后诱导蛋白质构象变化（图3）。构象的改变将不活跃的蛋白质转化为活性形式。构象变化的机制尚不完全清楚，但Jinek及其同事假设CRISPR Cas9蛋白质侧链和RNA碱基之间的空间相互作用或弱结合可能会导致这种变化。
图3：通过与向导RNA结合来激活CRISPR Cas9蛋白。向导RNA的结合诱导CRISPR Cas9蛋白的构象改变。构象变化导致CRISPR Cas9核酸酶活性激活。（图像来自PDB：4UN3）
一旦CRISPR Cas9蛋白被激活，它就会通过与原间隔基序PAM序列匹配的序列结合，随机搜索目标DNA。PAM是一个两碱基或三碱基序列，位于与向导RNA互补的区域的一个核苷酸下游。PAMs已在所有CRISPR Cas系统中被鉴定，定义PAM的特定核苷酸特异于CRISPR cas系统的特定类别。化脓性链球菌中的PAM为5′-NGG-3′结构。当CRISPR Cas9蛋白找到具有适当PAM的潜在靶序列时，该Cas9蛋白将熔化PAM上游的碱基，并将其与向导RNA上的互补区配对。如果互补区和靶区正确配对，RuvC和HNH核酸酶域将在PAM上游第三个核苷酸碱基之后切割靶DNA（图4）。
图4. CRISPR Cas9蛋白结合和切割靶DNA。
1） CRISPR Cas9蛋白扫描可能的目标DNA，寻找合适的PAM（黄色星星）。
2） 当CRISPR Cas9蛋白质找到PAM时,蛋白质和向导RNA复合物将熔化PAM上游的碱基，并将它们与向导RNA上的目标互补区配对。
3） 如果互补区和靶区配对正确，RuvC和HNH结构域将在PAM上游第三个碱基之后切割靶DNA。（图像，PDB：4UN3 渲染的左下和右下；从PDB：4CMP渲染的左上）
This article is adapted from Cavanagh & Garrity, “CRISPR Mechanism”, CRISPR/Cas9, Tufts University
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