如何判断细胞是否被污染?细胞污染的表现
作为一名科研人，细胞培养是一个必备的技巧，但是并非每个人都能熟练掌握，特别是在实验中出现突发情况，比如日夜照顾的宝贝细胞被污染了？
细胞被污染了怎么办？该怎么处理？接下来我们针对各个类型的污染一起学习和分辨一下。
细胞污染通常是指细胞培养中的生物污染，主要类型有细菌污染、支原体污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染等。不同的类型表现各不相同。
1、细菌污染
细胞被细菌污染的特征
肉眼观察特点：
◆ 细菌污染时细胞培养基可能在4-6小时呈现混浊。
◆ 有时稍加震荡，便会有很多混浊物漂起。
◆ 背景脏乱差，而没有被细菌感染的则背景干净。
显微镜下观察特点：
◆ 细菌污染的细胞低倍镜下观察不到正常细胞形态，黑色沙粒状布满细胞间隙或培养基，或背景有大量黑点，高倍镜下可见杆状或球状的细菌在培养基中游动。
需注意，在污染初期，细菌常成群存在，不一定会有明显的运动，此时需引起警惕。
图1. 细菌感染细胞
受细菌污染的细胞形态将会发生怎样的变化呢？
细菌污染可能造成细胞增殖缓慢或形态上的改变（多角、多核等），胞质中产生空泡、细胞漂浮凋亡，细胞被毁容。
显微镜下如何区分细菌菌体与细胞碎片？
菌体与细胞碎片的区别(见图1)
菌体小而密，细胞碎片大而稀；
菌体较规则，细胞碎片不规则；
如何处理被细菌感染的细胞？
细菌的克星是抗生素
| 抗生素 | 作用对象 | 使用比例 | 储存条件 |
| 卡那霉素 | 溶液细菌（如G+、G-、支原体） | 稀释:1:100 | -20℃ |
| 硫酸庆大霉素 | 溶液细菌（如G+、G-、支原体） | 稀释:1:1000 | AMB(15-30℃) |
| 青链双抗 | 细菌（如G+、G-） | 稀释:1:100 | -20℃ |
| 青链双抗，10浓缩液 | 细菌（如G+、G-） | 稀释:1:1000 | -20℃ |
| 青链霉素，制霉菌素三抗 | 细菌（如G+、G-）、 真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释:1:100 | -20℃ |
| 青链霉素，两性霉素B三抗 | 细菌（如G+、G-）、 真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释:1:100 | -20℃ |
| 青链霉素，新霉素三抗 | 细菌（如G+、G-） | 稀释:1:100 | -20℃ |
以下是几个经典的细菌污染案例：
图2. 球菌和杆菌感染细胞
2、 真菌污染
被真菌感染细胞的特征
真菌污染的细胞一般培养液清亮，不变色。比较容易发现，肉眼可见点状菌落，淡黄色或者白色漂浮在培养基表面。镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，像珊瑚状，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。
肉眼观察特点：
◆ 真菌污染最短3天才能长出椭圆形的霉斑。
◆ 霉斑往往会漂浮在培养液表面，随着时间逐步扩大。
显微镜下观察特点：
念珠菌
◆ 有些真菌呈类似棉花絮状的漂浮物。
◆ 若是念珠菌会呈卵圆状，在细胞周边生长。
根霉菌
◆ 早期并不会使得培养基变黄变浑浊，但在显微镜下可观察到菌丝体。真菌形成的菌丝呈丝状，管状，树枝状，串珠状。
酵母菌
◆ 细胞被污染后，仍可生长，长时间细胞的活力状态会变差。
◆ 梅雨季时的污染率会提高。
◆ 呈卵圆状酵母菌增殖到一定规模，形成团簇状的真菌群。
如何处理被真菌感染的细胞？
真菌的克星-抗生素
| 抗生素 | 作用对象 | 使用比例 | 储存条件 |
| 两性霉素B | 真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释:1:1000-1:10,000 | -20℃ |
| 制霉菌素 | 真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释:1:100-1:1000 | -20℃ |
| 青链霉素，制霉菌素三抗 | 细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释: 1:100 | -20℃ |
| 青链霉素，两性霉素B三抗 | 细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释: 1:100 | -20℃ |
以下是几个经典的真菌污染案例：
- 根霉菌污染 -
- 酵母菌污染 -
- 白色念珠菌污染 -
图3. 真菌感染细胞案例
3、支原体污染
细胞被支原体感染的特征
细胞被支原体污染后，培养液一般会浑浊。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
支原体污染特征：
◆ 增殖减慢
◆ 上清液清澈
◆ 背景干净
◆ 细胞形态异常（拉丝、铺展）
◆ 细胞轮廓不清，边界模糊；凋亡细胞过多
◆ 更换新的培养液，细胞状态没有恢复
图4. 支原体感染的细胞出现变化，出现A. 拉丝、 B. 铺展、C. 模糊不清等现象。
如何处理细胞培养中的支原体感染？
选择支原体检测试剂和支原体杀除试剂。
但是，一旦细胞感染了支原体，是很难根除的，往往要丢弃细胞。
发现支原体污染，最好的方法是丢弃感染的细胞培养瓶。在培养的细胞不可替代或非常昂贵的情况下，有一些方法来拯救培养的细胞。
支原体清除剂（Mycoplasma Removal Agents -MRA）是喹诺酮类抗生素的衍生物，青霉素、链霉素的联合用药。MRA可用于洗涤细胞培养物。根据感染的严重程度，需要几周到几个月的传代培养。这些方法不能保证完全清除支原体，但可以消除大部分支原体污染，是最后的选择。治疗的时间会影响细胞的生长和活力。如果支原体对细胞培养产生了永久性的损害，那么它是不可修复的。
4、黑胶虫污染：
细胞被黑胶虫感染的特征：
关于黑胶虫的分类，学术界没有明确的定义。低倍镜下观察时可见黑色小点，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去，在液体中活跃游动、旋转梭动。培养液不浑浊，对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失。复苏或传代时往往会出现黑胶虫污染，并且与细胞呈现此消彼长的现象。从黑胶虫污染细胞样本中分离得到黑胶虫，然后从黑胶虫中提取基因组DNA进行基因测序及分析，鉴定出的黑胶虫为无色杆菌属(Achromobacter)。
图5. 黑胶虫
如何处理被黑角虫感染的细胞？
黑胶虫污染顽固，要消除黑角虫可以使用黑胶虫清除剂，其所含有的多肽活性成分，相比传统抗生素有效清除黑胶虫；清除周期短，视黑胶虫污染程度通常3-6天可有效根除。
5、病毒污染：
细胞被病毒污染的特征
细胞被病毒污染极为隐蔽，很难用常规的方法检测到。受病毒污染的细胞液通常清亮无变化，大多数受病毒污染的细胞不会产生形态变化及细胞病理现象，少部分病毒会造成细胞变圆、肿胀，脱落。
病毒的主要来源是动物血清或者细胞系，常见于杂交瘤细胞。
组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。
如何处理被病毒感染的细胞？
一旦怀疑细胞被病毒感染，可用血细胞吸附试验、免疫荧光抗体法及电子显微镜法有效检出病毒。
通常病毒物污染的清除是十分困难的，可以重新引入高质量的细胞株。
对于确定污染的细胞最好的办法就是及时丢弃，积极排查细胞污染的原因。
6、细胞交叉污染
由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染，即细胞交叉感染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。
细胞交叉污染的特征：
即不同的细胞混杂在一起。
细胞交叉污染的鉴定方法：
同种属：STR鉴定，多等位基因数大于3个。需考虑本身的遗传背景，例如，EA.hy 926为融合细胞，本身就包含两套遗传信息。
不同种属：PCR法，对种属特异性基因进行扩增，不同种属产物大小不同。
细胞交叉污染的处理方法：
建议重新引种。
相关阅读