如何防止细胞污染?细胞污染了怎么补救?微生物污染的种类

细胞培养
2024-08-22


细胞培养是一项细致而艰难的工作,在细胞培养过程中,要特别注意防止微生物污染,一旦细胞被微生物污染,轻则珍贵的要被细胞废弃,重则连累整个培养箱,甚至培养室!

如何防止细胞被微生物污染?

细胞污染的表现和微生物污染分类

细胞污染是什么样子?

一、细菌污染

细菌污染是细胞培养中最常见的污染,其污染主要来源于实验室环境、实验人员、实验服、实验用具等,甚至在细胞培养过程中添加抗菌素(一般为预防剂量),也可能因为操作不慎而引起污染。


种类:造成细菌感染最常见的有革兰氏阳性菌如枯草杆菌、葡萄球菌等;大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌也会造成细菌感染。


特点:细菌污染的培养液通常会出现浑浊、PH下降,也有少部分会出现培养液肉眼观察无多少改变,只能在镜下发现菌体才知污染情况,建议每天仔细观察;被污染的细胞在显微镜下可以观察到细胞胞浆出现大量颗粒,细胞变圆或者崩溃,从壁上脱落死亡。一般细菌污染进程很快,大约污染一两天后肉眼就能显著观察到变化。


球菌和杆菌感染细胞1.jpg

图1. 球菌和杆菌感染细胞


二、真菌污染

真菌污染是细胞培养过程中最常见的另一种污染,尤其在霉雨季节,霉菌污染尤为严重。另外由于真菌可以通过孢子繁殖,因此一旦污染很容易发生扩散。


种类:常见的真菌感染有烟曲霉菌、黑曲霉菌、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌污染等。


特点:霉菌污染的细胞培养液短期内一般不会浑浊,可在培养液表面形成白色或黄色漂浮物(斑点状,易于观察);高倍镜下可见明显的丝状、管状或是树枝状的菌丝纵横交错在细胞间;念珠菌和酵母菌污染一般会成卵圆形散在细胞周边,并且酵母菌污染会导致培养液浑浊。真菌污染会与细胞抢夺营养,还会释放次级代谢物毒害细胞,造成细胞活力变差,生长速度变慢,甚至死亡。


酵母菌和霉菌感染的细胞magigen.com

图2. 被酵母菌和霉菌感染的细胞


三、支原体污染

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间,并独立生活的原核微生物,广泛存在于人和动物体内。


种类:细胞培养中常见的支原体有口腔支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、肺炎支原体和发酵支原体,其中前四者占据支原体污染的绝大比例。


特点:支原体大小为0.1-0.3µm,可以轻易通过我们常用于除菌的0.22µm和0.45µm孔径滤膜;并且在常规光学显微镜下无法观察到,荧光显微镜下可用DAPI染色观察到支原体污染;此外支原体无细胞壁,可以直接且紧密结合宿主细胞细胞膜,适当条件下可能导致细胞融合。


支原体污染具有隐蔽性,他们可以与细胞长期共存,培养基一般不浑浊。大部分细胞被污染后似乎无明显变化,但其实支原体会抑制细胞生长,并且导致染色体畸变等,对细胞培养实验影响巨大。


被支原体污染的细胞magigen.com

图3. 支原体感染的细胞前后对比图


四、黑胶虫污染

黑胶虫是一种生物还是非生物,学术界至今还有争议。这里我们暂且将其认作是一种微生物。黑胶虫污染主要来源于血清。


特点:黑胶虫污染起初对细胞并无影响,当达到一定数量时则会影响细胞生长。受黑胶虫污染的细胞液通常清亮无变化,在高倍显微镜下可以观察到点状片状的游动小体,做布朗运动。


微镜观察的黑胶虫2.jpg

图4.   透射电镜和光学显微镜下观察的黑胶虫


五、病毒污染

病毒作为一种比支原体更小的微生物,体型在nm级,很难用常规方法检测到。病毒污染分为外源性和内源性,污染主要来源为细胞系,常见于杂交瘤细胞。


特点:病毒污染的细胞液通常清亮无变化,大部分被污染的细胞也不会产生形态及病理现象,小部分病毒会造成细胞变圆、肿胀、脱落。


病毒污染可用血细胞吸附实验、免疫荧光抗体法以及电子显微镜法检测,但其清除是十分困难的,一旦不幸被污染,建议直接重新引入高质量细胞株。


微生物污染预防

微生物污染在细胞培养中是非常常见的,也是令人头大的一件事情。所以我们一定要将问题扼杀于摇篮之中,规范实验中的各个步骤,确保细胞“宝宝”在无污染的情况下健康成长。


1.实验进行前,准备好所需的试剂和器材。玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:

1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;

2)干烤消毒140℃2小时以上。


2.培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内,用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4℃保存。


3.消化液(pH7.8)或其它加入液,应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌,分装成支置-20℃保存。


4.超净台用紫外灯照射30-60min,并开启超净台风机运转5-10min,然后用75%酒精擦拭超净台台面,再开始实验操作。


5.实验进行时,佩戴好口罩及手套,穿上洁净实验服,有长发则将长发扎起或者佩戴帽子,避免灰尘或唾液进入培养物中。


6.进入超净台前应用75%酒精对双手及手腕进行全面擦拭,确保除菌完全。


7.实验用品用75%酒精擦拭后才能放入超净台内。


8.操作时小心取用无菌物品,应避免污染。勿碰触吸管尖头,不小心碰触后应立即更换;手及物品不要在暴露的瓶口上方来往,容器打开后,倾斜45度操作,操作完成后及时盖上瓶盖。


9.每次操作只处理一种细胞;即使不同细胞使用相同的培养基也不要共享同一瓶培养基,避免细胞间的交叉污染。


10.实验用品用完应移出超净台,以利于空气流通;实验完成后用75%酒精擦拭超净台台面。


11.定期清洗或更换超净台过滤膜、预滤网。


12.此外CO2培养箱的清洁是较易被忽视的地方,应1-2个月对培养箱定期进行清洁消毒。先用75%酒精擦拭培养箱内壁、隔板、水盘2-3次,用双蒸水清洗,再用酒精棉球擦拭一遍,最后紫外灯照射1h以上或进行高温高压灭菌处理。水盘内加入无菌水(应每周更换),待培养箱内温度、湿度、CO2浓度稳定后再放入细胞。


细胞污染了怎么补救?
细胞污染处理方法

微生物污染去除


首先,我们要知道,在任何情况下,完全去除细胞中的微生物污染是非常困难的!因为不管是哪一种操作,对细胞的生长而言都是一种额外刺激,很有可能导致细胞状态改变甚至死亡;而过度使用抗生素可能产生更强抗性的菌株,撤药后极易复发。


所以,对于易于重新获得的细胞株,我们建议直接处理培养物,不分敌我全部消灭,防止感染扩散!对于极为珍贵的细胞样本,我们可以尝试以下处理方法进行挽救。


如何去除细胞污染?

一、细菌、真菌污染处理方法

1. 用DBSS洗细胞(稀释污染物):

(a). 对于单层细胞,用DBSS浸洗培养物3次,胰蛋白酶消化,通过离心重悬用DBSS再洗细胞2次;

(b). 对于悬浮细胞,通过离心重悬用DBSS洗培养物5次。


2. 在新培养瓶以最低可行种植密度再接种。


3. 加入高浓度抗生素培养基,每2天换液。(一般在正常工作浓度的5-10倍,建议做梯度实验确保对污染物杀伤力较大,对细胞影响较小)


4. 用高浓度抗生素培养基再培养。


5. 重复步骤1~4,进行3次再培养。


6. 去掉抗生素,在无抗生素培养细胞的状况下再进行3次再培养。


7. 通过相差显微镜检查培养物并进行Hoechst染色。


8. 在无抗生素的条件下再培养细胞2个月,检查确定所有污染已被移除。


细胞培养正常抗生素浓度推荐表

抗生素浓度(μg/mL)作用对象
工作浓度细胞毒性浓度
两性霉素B2.530真菌
氨苄青霉素2.5--细菌(革兰氏阳性和阴性)
庆大霉素50>300细菌(革兰氏阳性和阴性)
卡那霉素10010mg/mL细菌(革兰氏阳性和阴性)
新霉素503000细菌(革兰氏阳性和阴性)
制霉菌素50--真菌
青霉素-G100U/mL10000U/mL细菌(革兰氏阳性)
多黏霉素B501mg/mL细菌(革兰氏阴性)
链霉素S0410020mg/mL细菌(革兰氏阳性和阴性)
四环素1035细菌(革兰氏阳性和阴性)

(数据源于参考文献1)


二、支原体污染处理方法

1. 用D-PBSA洗涤细胞(稀释可以减少污染物数量):


(a).对于单层细胞,用D-PBSA浸洗培养物3次,胰蛋白酶消化,通过离心重悬用D-PBSA再洗细胞2次;


(b).对于悬浮细胞,用D-PBSA离心重悬洗涤细胞。


2. 以高种植密度接种1个或者多个新培养瓶。


3. 加入高浓度抗生素培养基,每2天换液。


4. 用高浓度抗生素培养基再培养,如果不同类型的抗生素与BM-Cyclin交替使用,细胞应在应用新抗生素前换液。


5. 去掉抗生素,在无抗生素培养细胞的状况下培养细胞至少2周。


6. 用PCR或者其他支原体检测方法检测培养物。


7. 在无抗生素的条件下再培养细胞2个月,检查确定所有污染已被移除。


支原体去除抗生素浓度推荐表

商品名抗生素类型典型终浓度治疗周期
Baytril氟喹诺酮25μg/mL1 week
Ciprobay氟喹诺酮10μg/mL2 week
MRA氟喹诺酮0.5μg/mL1 week
Zagam氟喹诺酮10μg/mL1 week
Plasmocin氟喹诺酮25μg/mL2 week
蛋白合成抑制剂25μg/mL2 week
BM-Cyclin大环内酯物10μg/mL3 week
四环素5μg/mL3 week


(数据源于参考文献1)


三、黑胶虫污染处理方法

上面提到黑胶虫污染主要源于血清,故实验时尽量采用质量和口碑较好的血清培养。 黑胶虫早期污染一般采用如下方法:


1. 用0.25%的胰酶消化,当有少量细胞变圆或脱壁时,用血清终止消化;


2. 轻轻用培养液或D-Hanks液清洗3遍(缓缓流过细胞表面),不要吹打,吹散细胞;


3. 换培养瓶培养,隔天换液,2天后重复一次;


4. 此后每24-36h换液一次,一周后,黑点基本消失。


上述污染去除方案均是在细胞极其珍贵情况下的无奈之举,在细胞易于获得的情况下还是建议大伙儿直接处理掉污染的细胞,重新以新批次细胞进行试验,不仅节约时间,而且风险更小。


参考文献

1. R. Lan Freshney著,章静波,徐存拴等译. 动物细胞培养——基本技术和特殊应用指南(第七版).科学出版社,2020. magigen.com


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