分子检测

内标基因

核酸检测试剂盒基本都已经加入“内标”，主要分为“外源性内标”和“内源性内标”两种，下面我们结合实验室经常遇到的“样本内标扩增异常”情况，在实际检测中，我们经常会遇到的“样本内标扩增异常”情况，如何解决曲线异常的问题？在质控满足要求时，如何正确的认识核酸检测中的内标基因?

常见异常内标曲线及可能原因分析

➢外源性内标的异常内标曲线

1. 靶基因和内标均无扩增

常见原因：无法明确是否存在检验前问题，多数为检验中内标样本错加漏加、核酸加样时错加漏加；若连续多个样本存在此情况，首先考虑提取试剂、提取仪的问题。

2. 靶基因有扩增但内标无扩增

常见原因：应先明确靶基因是否同内标基因存在竞争或抑制作用，若不存在，原因同上，且该扩增孔存在污染可能。

例图1: 典型的高浓度样本抑制内标基因扩增

图1. 靶基因有扩增但内标无扩增

3. 外源性内标基因扩增明显离散

常见原因：外源性内标最大特点为均匀性好，故个别样本内标离散时多为反应体系中存在抑制物；部分连续样本内标离散时，应首先考虑提取试剂、提取仪的问题；若整板样本内标离散时，多为扩增体系配制时未充分混匀。

例图2: 该样本反应体系中存在抑制物。

图2. 单个样本内标基因离散

例图3: 由于磁珠残留、加热模块异常，造成多个连续样本内标基因离散。

图3. 多个样本内标基因离散

针对以上外源性内标曲线异常现象的应对措施：

更换试剂、耗材、仪器等条件进行复检；重新采样检测并严格按照sop操作等。

➢内源性内标的异常内标曲线

检验人员需首先明白内源性内标有扩增不代表采样成功，

原因有3点：

A. 对于混采样本，只需1个受试者采样成功，内源性内标就会有扩增；

B. 以RNase P内标为例，如不能正确采样，仅采集口腔甚至皮肤样本，同样会有内源性内标扩增；

C. 环境中可能会存在人源性样本气溶胶污染。但是，采样不成功时，内源性内标一定无扩增。

1. 靶基因和内标均无扩增

常见原因：实验室较为常见，涉及范围较广，包括检验前样本采集、保存、运送问题；检验中反应体系、提取、扩增问题以及人员操作问题等。

2. 靶基因有扩增但内标无扩增

常见原因：情况极其少见，因内源性内标基因与靶基因通常无竞争或抑制作用，所以原因同上，且该扩增孔可能存在污染或非特异性扩增。

例图4: 采样失败且靶基因非特异性扩增。

图4. 靶基因非特异性扩增且内标无扩增

3. 内源性内标基因扩增明显离散

常见原因：由于采样质量直接影响内标扩增结果，故曲线较离散属于正常情况，并不一定是人员不规范操作引起的，所以这种情况较难界定。

例图5: 若排除检验前问题，整体内标曲线相对离散，可能由于样本未充分振荡混匀或扩增体系配制时未充分振荡混匀。

图5. 内标基因离散

针对以上内源性内标曲线异常现象的应对措施：

更换试剂、耗材、仪器等条件进行复检；重新采样检测并严格按照sop操作等。

➢其他常见的异常内标曲线

1. 曲线明显分为两簇

常见原因：

A. 可能是提取仪异常导致提取效率低，多为加热模块故障、磁珠异常或磁珠残留；

B. 可能所用的反应液放置时间过长导致扩增效率下降；

C. 可能是不同的采样管内的保存液对提取试剂的提取效率有影响。

图6. 扩增曲线分为两簇

2. 内标曲线不平滑(靶基因曲线正常)

常见原因：多为错用扩增程序，如A试剂反应体系使用了B试剂的扩增程序，可重新选择正确的荧光通道。

图7. 内标曲线不平滑

总结

不同的内标都各有利弊，实验室应根据具体的使用需求，科学看待和选择。即“有内标不一定行，但无内标一定不行”。

核酸检测过程中的每一个操作环节都有可能影响检测结果，所以实验室必须规范化管理，出现样本内标异常结果时也应细心观察、耐心分析，采样人员采样时也应规范合理，最终保证核酸检测的质量。

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