图1：使用脂质体转染递送gRNA和Cas9。magigen.com

脂质体带有正电荷，可以与带负电荷的核酸形成复合物。这些复合物被认为带有净正电荷，使得细胞容易摄取质粒。

美格生物小贴士：

• 提高转染效率：使用传代次数较少的细胞，并且细胞密度保持在70%至90%之间。

• 使用最新的高效转染试剂：例如Magigen Lumiere CRISPR/Cas9 Nanoparticles（Cas9/sgRNA NPs）, 可以大幅提高难转染细胞的成功率。

• 优化转染质量：确保核酸质量高。可以通过测量核酸在260nm处的吸光度与280nm处的吸光度之比（A260/A280）来估计核酸的质量。高质量的DNA通常具有约1.8的A260/A280比值；高质量的RNA具有约2.03的A260/A280比值。

• 调整转染参数：如果难以将gRNA和Cas9递送到易于转染的细胞系中，请尝试改变核酸与脂质体的比例、细胞密度以及转染试剂的体积。

• 避免抗生素：转染过程中不要添加抗生素，因为它会导致细胞死亡。

2：电穿孔

电穿孔是一种利用短暂的电脉冲（通常是300至400毫伏，持续不到一毫秒）在细胞膜上产生临时孔洞的技术，使得DNA或RNA能够进入细胞（见图2）。

图2：使用电穿孔递送gRNA和Cas9。

细胞电穿孔的原理

电穿孔通过让细胞暴露于短暂的电脉冲下，扰动细胞膜并形成临时孔洞。这些孔洞是导电的，因此像gRNA和Cas9这样的带电分子可以通过细胞膜并进入细胞内部。

优点

• 快速：使用电穿孔递送DNA或RNA只需要几分钟的时间。一旦优化了电穿孔条件，您可以在短时间内将gRNA和CRISPR Cas9转染到大量的细胞中。

缺点

• 设备需求：您需要自行建造或购买电穿孔装置来进行电穿孔。如果只是偶尔使用，可能难以证明为此付出的努力是值得的。

• 细胞损伤：由于电穿孔涉及向细胞施加高强度电脉冲，这可能导致大量细胞死亡。因此，重要的是要为每种类型的细胞测试并优化电脉冲的强度和持续时间，以最小化过程中的细胞损伤或死亡。

小贴士

• 去除杂质：盐类和蛋白质会降低电穿孔效率，因此重要的是要将核酸纯化并在水或TE缓冲液中溶解。

• 恢复培养：电穿孔后的细胞比较脆弱，所以必须立即向细胞中加入恢复培养基，以维持其健康状态。

电穿孔协议准备工作

1. 准备细胞：收获处于对数生长期的细胞，并将其离心收集。用PBS洗涤细胞两次，然后重悬于电穿孔缓冲液中，使细胞浓度达到1 x 10^7个细胞/mL。

2. 准备核酸：确保核酸已纯化并经过质量检测（如A260/A280比值测试）。

1. 混合细胞与核酸：按照实验设计所需的量将gRNA和Cas9加入到细胞悬液中，轻轻混匀。

2. 电穿孔设置：根据电穿孔仪的说明，设置适当的电压、脉冲长度和其他参数。

3. 电击：将混合好的细胞和核酸转移到电穿孔杯中，并按照设定的参数进行电击。

4. 恢复培养：电击完成后，立即将细胞悬液转移回培养皿中，并加入适量的预热培养基，以帮助细胞恢复。

请根据实际实验条件和具体细胞系调整上述步骤。

细胞电穿孔协议参考：如何进行细胞电穿孔?电穿孔方案实例

细胞电穿孔注意事项

• 在电穿孔前后应监测细胞活力，以评估电穿孔对细胞的影响。

• 根据细胞类型和实验要求，可能需要调整电压和脉冲长度。

• 电穿孔后立即观察细胞，并在必要时更换培养基，以减少细胞应激反应。

3：慢病毒转导

我们还可以使用慢病毒载体递送gRNA和Cas9，慢病毒载体源自一类称为人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的逆转录病毒亚类。

首先，我们需要在293T细胞中转染质粒来组装功能性慢病毒颗粒。然后，收获这些慢病毒颗粒，并将它们转导到目标细胞中。当慢病毒颗粒进入细胞后，病毒RNA（包括您的gRNA和Cas9）会被逆转录，导入细胞核，并随机插入到细胞的基因组中（见图3）。您可以从Broad研究所或Trono实验室找到慢病毒转导的协议。

慢病毒转导的优点

• 高效：慢病毒转导可以高效地递送gRNA和Cas9到多种类型的细胞中，包括那些难以转染的细胞，即使是最难转染的细胞系（包括分化神经元），递送效率也很高。

• 稳定性：由于慢病毒可以整合到宿主细胞的基因组中，因此可以长期稳定表达gRNA和CRISPR Cas9。

慢病毒转导的缺点

• 安全性考虑：使用慢病毒转导涉及到潜在的基因组整合风险，可能会导致基因组不稳定或引发其他安全问题。

• 复杂性：与简单的转染方法相比，慢病毒转导的过程更为复杂，需要更多的实验步骤和技术知识。

• 基因组整合风险：病毒基因组随机整合到宿主基因组的位置不可控，可能会影响细胞的重要功能。如果您担心这个问题，可以考虑使用腺相关病毒（AAV）。

• 劳动密集型：生产并转导慢病毒颗粒的过程繁琐，大约需要两周的时间。

美格小贴士

• 高产量：应在转染前24小时内准备293T细胞，以实现高效的病毒生产。

• 分装保存：生成慢病毒颗粒后，将病毒库存分成小份保存，这样就不必经常冻融。

• 细胞健康：如果慢病毒转导后细胞看起来不健康，可以尝试减少使用的慢病毒颗粒量或在转导后4小时更换生长培养基。

• 优化转导：优化包装细胞的转染条件和培养条件，以获得更高的病毒滴度。

• 选择性标记：使用含有抗性标记的载体可以帮助筛选转导成功的细胞。

如果您需要更详细的指导或有关于特定细胞系的问题，请随时告诉我。

图3：使用慢病毒转导递送gRNA和Cas9。

慢病毒颗粒通常通过将三种质粒转染到293T细胞中来生产：

(1) 假型质粒；

(2) 克隆质粒；

(3) 包装质粒。假型质粒编码包膜蛋白（紫色）；克隆质粒包含ψ包装序列、您的gRNA和Cas9；包装质粒含有衣壳蛋白（棕色）和逆转录酶（灰色）。293T细胞表达这些质粒并产生慢病毒颗粒。收获慢病毒颗粒后，可以将其转导到目标细胞中。一旦进入细胞内，逆转录酶（灰色点）将病毒RNA基因组逆转录成病毒DNA基因组。病毒DNA基因组随后被导入细胞核并随机整合到细胞的基因组中。您的细胞将在慢病毒转导后24-48小时内稳定表达gRNA和Cas9。

下一步是什么？

在上一篇文章中，我们讨论了在一些最常见的细胞系中哪种方法能提供最佳的递送效率。在本文中，我们解释了如何实施递送方法。在下一篇文章中，我们将讨论可用于检测细胞中插入和缺失（indel）的功能性实验。这些实验将帮助您验证CRISPR-Cas9系统的基因编辑效果。

敬请期待！

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