如何进行电穿孔

本方案改编自Alberto Martin实验室的研究生Alex Ling的工作方案。他使用CRISPR技术处理CH₁₂F₃-2细胞。

进行电穿孔需要的材料材料

• CH₁₂F₃-2细胞

• CH₁₂F₃-2细胞培养基

• RPMI 1640 + L-谷氨酰胺

• 10% 胎牛血清

• 5% NCTC-109培养基

• 50μM 2-巯基乙醇

• 5毫升1000倍浓缩青霉素/链霉素溶液

• 4毫米电穿孔杯（VWR）

• ZAP缓冲液

  • 25mM HEPES

  • 0.75mM Na₂HPO₄

  • 140mM KCl

  • 5mM NaCl

  • 2mM MgCl₂

  • 0.5%（重量/体积）Ficoll

如何进行电穿孔？     电穿孔的步骤

准备电穿孔用的细胞

1. 在电穿孔当天，确保CH₁₂F₃-2细胞处于对数生长期。通常情况下，前一天接种1百万个细胞于10毫升CH₁₂F₃-2细胞培养基中即可。每个电穿孔需要1百万个细胞。

电穿孔

2. 将1百万个CH₁₂F3-2细胞悬浮于600微升ZAP缓冲液中，然后与5微克CRISPR构建体混合，在4毫米电穿孔杯中组合。

3. 在BioRad GenePulser Xcell电穿孔仪中进行电穿孔，条件如下(表1)：

表1 电穿孔仪器的参数设置   magigen.com

4. 立即把电穿孔后的细胞置于冰上，孵育5分钟，然后将其铺板于10毫升CH₁₂F₃-2细胞培养基中，并在37摄氏度、5% CO₂条件下孵育。

关键步骤

立即把电穿孔后的细胞置于冰上，孵育5分钟，然后将其铺板于10毫升CH₁₂F₃-2细胞培养基中，并在37摄氏度、5% CO₂条件下孵育。

5. 将2×10^6个细胞悬浮于100微升电穿孔溶液中，并加入2毫米电穿孔杯。

6. 加入5微克CRISPR/Cas9和gRNA质粒。

7. 以250伏特电压电穿孔5毫秒。

8. 立即将电穿孔后的细胞转移至1毫升细胞培养基中。

关键步骤

尽量缩短电穿孔与转移细胞之间的时间，以提高细胞活力。

电穿孔后72小时

9. 将电穿孔后的细胞连续稀释至10-20个细胞/毫升，并使用多通道移液枪将100微升细胞悬液分配至96孔平底板。通常情况下，每孔20个细胞、总共10块96孔板可以获得大约100个克隆，非常适合96孔PCR板的使用。也可以使用单细胞分选法，但这较为昂贵！

需要使用血球计数器进行准确而精确的计数；例如，一个视野中计数12个细胞并不准确。每次稀释不要超过1:100的比例。

理论上，每孔0.2个细胞（20个细胞/毫升），总共10块96孔板应该可以获得192个克隆，但由于细胞吸附塑料而造成的损失，实际上获得的克隆数目会少于理论值；不过，您通常可以稳定地获得大约100个克隆。您可以筛选较少的克隆，但开始时至少筛选96个克隆是可行的，经过练习后，同时筛选两个构建体（2×96个克隆）也是可行的。

需要注意的是，电穿孔后72小时的休息期可能不是所有基因的最佳选择，特别是那些缺失会导致生长缺陷的基因。

10. 将克隆铺板后的细胞放置于长期37摄氏度的培养箱中，以减少水分蒸发，培养7至10天。克隆在第4-5天时可以通过显微镜观察到，在第5-7天时肉眼可见。从第24步开始，时间安排有一定的灵活性。

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