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CRISPR Cas13，治疗肌营养不良症最新方法

Magigen

2021-04-23

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CRISPR Cas13蛋白为肌营养不良症患者带来福音

什么是肌营养不良症？

肌营养不良症症状，英文名：Facioscapulohumeral muscular dystrophy，简称：FSHD，是一种遗传性肌肉疾病，受其影响最严重的是脸，肩，上臂等部位的肌肉。

FSHD肌营养不良症症状

在医学文献中，这种疾病被称为面肩肱型肌营养不良症。肌营养不良症是一组遗传性骨骼肌变性疾病，肌肉的损失并不局限于面部、肩胛骨和肱骨，病理上以骨骼肌纤维变性、坏死为主要特点，临床上以缓慢进行性发展的肌肉萎缩、肌无力为主要表现，部分类型还可累及心脏、骨骼系统。

FSHD是最常见的进行性肌肉疾病之一，影响到全球至少50万人。由于FSHD由于表现不同和缺乏认识而经常误诊，因此实际患病率可能要高得多。大约三分之二的病例是父母遗传的。三分之一的FSHD似乎是自发遗传突变的结果。

肌营养不良症FSHD遗传学原理

目前，FSHD被认为是由一个叫DUX4的基因引起的。与其他遗传病的基因不同，DUX4本身并没有突变。事实上，它通常被锁起来，保持沉默，这样基因就永远不会被打开。DUX4从未打开的原因，是因为它是一个重复的DNA元素，这意味着基因反复重复，形成一个长链，称为D4Z4，通常重复200次；然而，FSHD患者通常重复不到10次。

利用CRISPR Cas13蛋白沉默dux4 mRNA，治疗肌营养不良症FSHD

这张图显示了4个D4Z4单元的连续外观。橙色是DUX4基因。蓝色三角形是D4Z4的一个链节。

为什么短D4Z4链会导致DUX4打开？答案还不清楚，但有一个观点, 通常基因组中重复的元素会压缩，使DNA折叠得非常紧密，就像纱线的骨架。当DNA全部被卷起时，DUX4无法打开。一般情况下，细胞知道要把DUX4压缩，但有时却不知道。

我们过去认为只有当D4Z4链少于10个时，DUX4才会解压。但凡事都有特例，这条规则也有例外。例如，，但我们发现有超过10个重复的患者组。

这些病人发生了一些不同的情况。研究人员发现，另一个基因SMCHD1（SMOTCH）的突变导致了第二种FSHD，称为FSHD2。

FSHD2仍由DUX4引起；正是这样，SMCHD1是压缩机制中非常重要的一部分。如果SMCHD1不能正常工作，DUX4纱的骨架仍会分解，对细胞造成破坏。

将SMCHD1确定为FSHD2的病因，这再次证明DUX4在肌肉萎缩的发生中起着核心作用。但仍有很多东西需要研究。FSH研究之友帮助资助了一些研究，使前面的设想成为可能。8年前，人们还不确定DUX4是否会导致这种疾病，没有人听说过SMCHD1，而D4Z4只是实验室笔记本上的三角形。

肌营养不良症能治好吗？

由于FSH研究之友的支持、捐赠，科学家可以继续进行针对FSHD治疗或治愈的开创性研究。

CRISPR技术的进步导致了分子生物学的一场革命，它提供了精确校正所需DNA序列的机制，从而为开发精确的基因疗法铺平了道路。

利用新的CRISPR技术，我们乐观地认为FSHD是一种可治疗的疾病。Magigen CRISPR Cas13蛋白也可以助解决之道一臂之力。

利用CRISPR Cas13蛋白沉默dux4 mRNA，治疗肌营养不良症

项目负责人: Afrooz Rashnonejad PhD, Postdoctoral Scientist, Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children's Hospital

传统的CRISPR Cas9蛋白介导的基因编辑方法依赖于在特定染色体位置，切割突变的DNA序列，并用新的DNA序列修复或替换编辑的区域。理想情况下，CRISPR Cas9系统将设计成仅在预期位置切割基因组，从而仅纠正致病病变，同时避免在其他地方切割基因组。

尽管这种方法具有高度的特异性，但脱靶效应仍然是一个值得关注的问题，因为人类基因组包含30亿段代码，即使是很小的错误率，也可能导致许多永久性和非预期的基因改变。由于肌肉中有毒的DUX4基因的表达，FSHD更难实现这种精确性问题。治疗FSHD最直接的方法是关闭DUX4基因，或对其进行突变，使其失去功能。然而，数百个完全相同或几乎完全相同的DUX4拷贝嵌入整个人类基因组的DNA重复序列中（称为D4Z4），这种DNA序列的相似性使得制造一个精确的CRISPR/Cas9系统具有挑战性，该系统只会破坏与FSHD相关的DUX4拷贝。换句话说，一个以DUX4为靶点的CRISPR Cas9系统可能在全基因组范围内切割数百个位点，甚至产生更短的D4Z4重复序列，这实际上可能导致肌肉中产生更多、而不是更少的DUX4。因此，开发CRISPR Cas9治疗FSHD的方法需要格外小心。

研究人员不使用更传统的CRISPR-Cas9系统来沉默DUX4基因，而是开发另一种基于CRISPR Cas13蛋白酶的系统，它可以靶向dux4 mRNA而不是DNA。研究人员认为CRISPR Cas13蛋白介导的dux4 mRNA沉默具有优势，因为它仍然可以使用CRISPR实现DUX4基因沉默，但不会在可能的数百个地方破坏基因组。因此，本项目的目标是开发一种临床前基因治疗方法，利用CRISPR/Cas13沉默人细胞和小鼠肌肉中的dux4 mRNA。强有力的体外初步数据显示，负载CRISPR Cas13靶向DUX4转录，显著降低毒性DUX4蛋白，提高细胞活力。在这里，研究人员建议通过建立一种基因治疗载体，在动物模型中敲除DUX4，进一步发展这种体内方法。在完成这项研究的目标后，期望产生临床前数据，支持基于AAV的CRISPR/Cas13治疗FSHD的新方法。

利用CRISPR Cas13沉默dux4 mRNA，治疗肌营养不良症研究进展：

FSH研究之友于2020年1月28日发布

FSHD是在肌肉中DUX4基因启动时引起的。DUX4基因产生一种对肌肉细胞有毒的蛋白质（也称为DUX4），随着时间的推移，足够的损伤会累积起来导致FSHD的肌肉无力。考虑到这一点，许多FSHD治疗研究现在集中在关闭DUX4基因在FSHD肌肉。CRISPR是一项热门的新技术，可以用来实现这一点。CRISPR Cas9可能是最著名的系统，因为它在过去几年中得到了大量的新闻报道。CRISPR Cas9酶的作用是编辑DNA，在我们的基因中产生永久性的修饰。然而，最近的CRISPR系统使用一种名为Cas13的酶，这种酶只能针对RNA，不能针对DNA。RNA是我们细胞中的重要分子。信使RNA（mRNA）将遗传物质（DNA）的信息传递到细胞的功能分子（蛋白质）中。因此，任何能够沉默mRNA的策略都可以在不改变DNA的情况下，阻止有毒的DUX4蛋白的形成。

在本研究中，研究人员试图验证这个理论：CRISPR Cas13可以减少FSHD细胞和动物模型中dux4 mRNA的数量，并保护细胞免受有毒DUX4蛋白引起的死亡。在过去的9个月里，研究人员使用了几种分子方法，证明CRISPR Cas13蛋白可以降低培养皿细胞或动物肌肉中DUX4的毒性。在第一步中，研究人员发现该系统有效地减少了FSHD细胞中的DUX4 mRNA，从而减少了DUX4蛋白。然后，研究人员将CRISPR Cas13元件包装到腺相关病毒（AAV）载体中，用于传递基因治疗，并将其传递到成年和新生FSHD小鼠模型中。两个模型都有DUX4水平，他们的肌肉显示出保护免受损伤。目前，研究人员正在尝试使用各种方法来提高这种治疗的效率。CRISPR-Cas13基因治疗有望成为治疗FSHD的有效方法。

利用CRISPR Cas13沉默dux4 mRNA，治疗肌营养不良症研究进展： FSH研究之友于2020年10月25日发布

继续研究CRISPR Cas13b系统在细胞和动物模型中降低DUX4 mRNA表达的能力。CRISPR Cas13b和gRNAs在体外显著降低DUX4蛋白水平。当在FSHD患者来源的成肌细胞中测试时，这个系统增加了活细胞的数量。为了提高这种治疗的效率，研究人员设计了一种新的结构，包含在不同启动子下表达的多个gRNAs。研究人员证明，gRNA单独表达是无毒的，不会诱导细胞因子的表达，即调节炎症和免疫反应的分子。这是将这种疗法应用于临床的一个重要安全方面。最后，研究人员测试了AAV.CRISPR-肌内注射成年FSHD小鼠模型中CRISPR Cas13b系统的研究。与在体外检测到的相似，CRISPR Cas13b蛋白成功靶向dux4mrna，减少凋亡细胞核，保护肌肉免于死亡。

为了研究CRISPR Cas13b蛋白和gRNA的长期表达，另一个临床相关的实验结果指标，研究人员注射AAV.Cas13b 以及scAAV.gRNA 进入小鼠肌肉，并在不同的时间间隔提取肌肉。有趣的是，他们检测到两个月内，这两种基因的表达持续增加。考虑到小鼠的寿命较短，约为1.5-2年，新陈代谢也较高，2个月的小鼠寿命大致相当于7-10年的人类寿命。下一步，研究人员打算在更长的时间点上研究基因表达，并进行更多的临床前研究，更快地将这种疗法转化为临床治疗提供更多的临床前数据。

利用CRISPR Cas13沉默dux4 mRNA，治疗肌营养不良症研究最新进展：

FSH研究之友于2021年4月20日发布

研究人员专注于研究成年FSHD小鼠模型中CRISPR Cas13b敲低DUX4表达的功效。为此，他们将AAV-DUX4，AAV-Cas13b和AAV-gRNA1肌内注射到C57BL/6小鼠的一条腿中。另一条腿只注射AAV-DUX4作为对照。CRISPR/Cas13b将DUX4诱导的肌肉损伤减少至未治疗腿中总损伤水平的25%。在治疗过的肌肉中，DUX4和DUX4相关的生物标志物表达水平显着下降。在注射的小鼠肌肉中检测到CRISPR Cas13b和gRNA1表达长达6个月，证明了CRISPR组分在动物模型中的长期表达和稳定性。最后，使用特定的染色方法，显示由于AAV载体将治疗剂递送到肌肉中的能力，Cas13b和gRNA已经在许多肌纤维中表达。

总之，使用FHSD衍生的肌管和共注射的成年FSHD小鼠模型的体外和体内结果表明，AAV-CRISPR-Cas13系统有望靶向并减少DUX4并防止DUX4介导的细胞死亡。然而，该系统仍需要更多优化，例如增加体内系统功效和研究CRISPR Cas13脱靶效应。

感谢FSH研究之友对本研究的支持。