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如何设置CRISPR Cas13a与恒温扩增检测反应体系

Jonathan

2021-04-02

广州美格生物提供全系列的CRISPR Cas蛋白、恒温扩增试剂、逆转录酶、侧向层析试纸条，用于基因编辑、快速检测。想了解详情，请点击：CRISPR Cas蛋白、恒温扩增试剂、逆转录酶、侧向层析试纸条

重要提示：本方案以张锋实验室的CRISPR Cas13a检测方案为参考，只用于科学研究，不可以用于临床。

CRISPR Cas13a与恒温扩增反应体系设置

A. 概述述

新型冠状病毒COVID-19可以通过qPCR进行诊断，但由于试剂和设备昂贵，疾病检测速度比较慢。为了提高COVID-19的诊断水平，我们在此介绍了一种基于张锋CRISPR的SHERLOCK技术与恒温扩增RDA技术结合，检测COVID-19的方法。利用人工合成的COVID-19病毒RNA片段，能够在20-200aM范围内（每微升输入10-100个拷贝），检测到COVID-19靶序列。该测试可以从患者样本中纯化的RNA开始进行，就像用于qRT PCR分析的一样，可以在不到一小时内用试纸读出，而不需要精密仪器。

SHERLOCK COVID-19检测方案分三步工作，像qRT-PCR一样，从核酸提取开始，可在1小时内完成。

实验步骤

（1）–25分钟孵育–使用重组酶聚合酶扩增（Magigen RDA or TwistDx RPA）试剂盒恒温扩增提取核酸样品；

（2）–孵育30分钟–使用CRISPR Cas13检测预扩增的病毒RNA序列；

（3）–2分钟孵育–使用Magigen CRISPR产物侧向层析试纸条目测读出检测结果。

以下部分详细介绍了所需的试剂以及步骤。

B、实验要求

为了检测标本核酸提取液中是否存在COVID-19病毒RNA，在COVID-19基因组的S基因和Orf1ab基因中选择两个靶点。设计RPA扩增引物和LwaCas13a蛋白CRISPR向导RNA进行特异性检测。为了最大限度地提高检测的特异性，要对靶标序列进行选择，最小化脱靶效应。

利用合成COVID-19的S基因和Orf1ab基因RNA片段, 连续稀释，能够检测到每微升10-100个拷贝的合成COVID-19病毒RNA序列。下面是不同输入浓度的侧向层析试纸条读数的示例图像：

CRISPR Cas13a蛋白与恒温扩增反应体系配置

C.材料和试剂

样本和核酸提取：

应根据适当的生物安全程序采集患者样本。本实验使用的CRISPR Cas13蛋白和恒温扩增试剂，大家可以采购市面上的商品，例如TwistDX, Magigen,NEB,IDT,ThermoFisher赛默飞等产品。

从步骤（1）开始，该方案的输入可以是与qRT-PCR分析中使用的相同的提取核酸。

试剂：

对于步骤（1）等温放大：

- TwistAmp® Basic (TABAS03KIT), TwistDx or Magigen RDA-Basic

- ProtoScript® II Reverse Transcriptase(M0368L), NEB or Magicscript Reverse Transcriptase (RTase) II，逆转录酶，RT酶

- RPA Amplification primer pairtargeting S gene (S-RPA-Forward_v1:

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGA-3’; S-RPA-Reverse_v1:

5’-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’), 可以从IDT或者Magigen购买

-靶向Orf1ab的RPA扩增引物对 (Orf1ab-RPA-Forward_v1:

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCGAAGTTGTAGGAGACATTATACTTAAACC-3’; Orf1ab-RPA-Reverse_v1:

5’-TAGTAAGACTAGAATTGTCTACATAAGCAGC-3’)

对于步骤（2），使用CRISPR Cas13蛋白检测病毒RNA：

-切割缓冲液(400mM Tris pH 7.4 in ddH2O). 预制，可采用1M Tris pH 7.4 stock solution from SigmaAldrich (T2194-100ML)

- SUPERase•In™ RNase Inhibitor (AM2694),ThermoFisher Scientific

- NxGen® T7 RNA Polymerase (30223-1),Lucigen

- Ribonucleotide Solution Set (N0450S),NEB

- Magnesium chloride solution (63069-100ML),Sigma Aldrich

- Storage Buffer for diluting Cas13protein stock (combine 2.5 mL of 1M Tris pH 7.4, 6 mL of 5M NaCl, 2.5 mL ofglycerol, and 100 μL of 1M DTT, and 38.9 mL ddH2O)

- 纯化CRISPR LwaCas13a蛋白 accordingto Kellner et al., Nature Protocols 2019, stored as 4ul aliquots at 2mg/mL. 可采用Magigen Cas13a蛋白。

- CRISPR LwaCas13a crRNA for detecting S gene(S-crRNA_v1:

5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3’), 可以从Magigen或者Synthego购买

- CRISPR LwaCas13a crRNA for detecting Orf1ab gene(Orf1ab-crRNA_v1:

5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCAACCUCUUCUGUAAUUUUUAAACUAU-3’)

- Reporter RNA for lateral flow read out(Lateral-Flow-Reporter:

5’-/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3’)

For Step (3) reading out using lateral flowdipstick:

- HybriDetect Dipstick (MGHD 1), MileniaBiotec GmbH Positive control sequences (can be produced using T7 transcription from synthesized DNA oligos):

- S gene fragment:

5’-UAACAUCACUAGGUUUCAAACUUUACUUGCUUUACAUAGAAGUUAUUUGACUCCUGGUGAUUCUUCUUCAGGUUGGACAGCUGGUGCUGCAGCUUAUUAUGUGGGUUAUCUUCAACCUAGGACUUUUCUAUUAAAAUAUAAUGAAAAUGGAACCAUUACAGAUGCUGUAGACUGUGC-3’

- Orf1ab gene fragment:

5’-UGAGUGUAAUGUGAAAACUACCGAAGUUGUAGGAGACAUUAUACUUAAACCAGCAAAUAAUAGUUUAAAAAUUACAGAAGAGGUUGGCCACACAGAUCUAAUGGCUGCUUAUGUAGACAAUUCUAGUCUUACUAUUAAGAAACCUAAUGAAUUAUCUAG-3’

设备：

-37°C水浴锅

-42°C水浴锅

-用于旋转1.5mL试管的微型离心机

D、实验方案

***重要提示：为防止样品污染混淆检测结果，应使用两个不同的工作区域执行步骤（1）和（2）。

步骤（1）应在预扩增区域进行，对污染特别敏感。放大后的样品不应在步骤（1）的工作区域打开。设立一个单独的区域用于扩增后反应，用于执行方案的步骤（2）。孵育后，步骤（1）的反应只能在扩增后区域打开。

另外，仅在扩增后区域中进行步骤（3）的反应。

***重要提示：在指定温度孵育前，所有反应要在冰上进行。

步骤（1）-等温扩增，在扩增前工作区域进行：

为了测试每个样品，设置两个RPA反应，分别用于检测S基因靶标和Orf1ab靶标。另外，可以使用合成的病毒片段建立S基因和Orf1ab的阳性对照。还应设置未添加测试样品的阴性对照。

使用RPA试剂盒中提供的29.5ul Rehydration再水化缓冲液重悬每个冻干的RPA沉淀。