如何利用CRISPR进行基因敲除(二)如何设计gRNA
CRISPR gRNA设计
这个教程是系列文章“如何使用 CRISPR 创建基因敲除”中的第2部分，共4部分。
现在我们已经决定了实验中使用的细胞系和 Cas9。是时候开始设计 gRNAs 了！为了敲除你感兴趣的基因的功能，你需要针对靠近 5' 端的连续表达的外显子。这种设计在发生移码突变时有很大可能产生非功能性蛋白。在这里，我们将逐步介绍所有必要的步骤，并讨论在 gRNA 设计中需要考虑的重要因素。我们还将展示如何使用软件设计 gRNAs。
如何设计gRNA?
设计gRNA的方法
如果要使用CRISPR/Cas9系统对基因组进行编辑，第一步也是最重要的一步，就是要设计gRNA。
现在有很多gRNA设计原件，各种软件使用的方法有不同。
下面美格君就用常用的在线gRNA设计网站：http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp 做介绍
进入该网站后，可以见到下面的设计页面：
图1. crispr-era的gRNA设计页面 magigen.com
Step1: 指定基因组的操作类型。
在CRISPR-ERA中，可以针对不同的基因组操作类型进行gRNA的设计。下面是具体的操作类型及其对应的gRNA设计规则：
使用nickase进行基因编辑：
在目标基因的基因编辑区域内寻找一对sgRNA（单导向RNA）。
这对sgRNA之间的偏移距离应在(-50 bp, +100 bp) 之间。
使用核酸酶nuclease进行基因编辑：
在目标基因的外显子区域内寻找sgRNA。
最终的sgRNA设计结果会指定目标外显子。
基因抑制Gene repression：
在目标基因转录起始位点（TSS）的 -1500bp 至 +1500bp 的区域内寻找sgRNA。
基因激活Gene activation：
在目标基因TSS的0 -1500bp 区域内寻找sgRNA。
美格小贴士：TSS 是 "Transcription Start Site" 的缩写，中文称为“转录起始位点”。在使用 CRISPR-ERA 工具设计 gRNA 时，了解 TSS 的位置可以帮助研究人员更精确地定位 gRNA 的作用区域，以实现特定的功能。
图2. CRISPR-ERA TSS位置图
Step2: 指定生物种类
在使用 CRISPR-ERA 设计 gRNA 时，您需要指定要进行基因编辑的生物种类（organism）。CRISPR-ERA 支持多种模型生物，包括细菌、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠和人类。
Step3: 选择具体的基因组
可以选择基因组的名称、TSS的位置、基因组的序列。
gRNA设计结果
输入完成后，点击 CRISPR-ERA search 按钮，可能会得到一批结果，供您选择。
也可以点击 I'm feeling lucky! , 得到系统认为的最佳选择。
但是出来的sgRNA位置有一些并不总在ATG的下游（图3所示，1，2，6，9，12，16，22几条sgRNA位于ATG的上游）。所以根据位置，对于做基因的敲除（KO）而言，建议选择ATG下游通常100 aa以内范围内的sgRNA来用（比如图3中的3，5，7，10等较下游的）；而且，一定要位于CCDS区域内（CCDS是consensus CDS，即公共的CDS区域，是针对很多个转录本[isoforms]定义，图3中路色条框即是。这个很重要！！！）。
图3. CRIPSR-ERA-gRNA设计结果
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