如何利用CRISPR进行基因敲除(三)如何合成gRNA
gRNA合成
本教程是系列文章“如何使用 CRISPR 创建基因敲除”中的第三部分。
为了编辑细胞的基因组，您需要同时将导向 RNA（gRNA）和 RNA 指导的 DNA 切割酶 Cas9 共表达到细胞中。
在本课程之前，美格君和大家一起讨论了如何选择最佳的 CRISPR/Cas9蛋白 以及如何优化 gRNA 的设计。
在本部分，我们将讨论如何合成将在细胞中表达以创建基因敲除的 gRNA。
图1. gRNA合成方法
本教程讨论了两种合成 gRNA 的方法，并分析了它们各自的优缺点。此外，还提供了每种方法的简要实验方案。下面是对这两种方法的总结：
方法 1：将 gRNA 克隆到质粒中(见图1)
优点
易于转染的细胞，如人胚胎肾 (HEK) 细胞，可以很好地吸收超螺旋 DNA，因此以质粒形式递送 gRNA，通常会产生比较高的转染效率。如果您使用易于转染的细胞系，这种方法可能非常适合您。
质粒易于扩增并适合长期储存。
缺点
对于一些细胞系，如人胚胎干细胞，很难以质粒形式递送 gRNA。研究表明，在某些情况下，如果以 mRNA 形式而不是质粒形式递送 gRNA，则递送效率更高。
提示
您可以利用软件工具设计引物，用于使用 BsaI、FokI 或其他 Type IIS 限制性内切酶将 gRNA 克隆到质粒中。
有些质粒，如 PX330 和 lentiCRISPRv2，也编码 Cas9，因此您只需要递送一个质粒即可在细胞中共表达 gRNA 和 Cas9。
如果您打算将相同的 gRNA 用于其他目的，如激活或干扰内源基因功能，您可以使用一个质粒表达 gRNA，另一个质粒表达 Cas9。
协议
订购寡核苷酸以合成 gRNA。
磷酸化并退火每对寡核苷酸（1小时）。
使用 BbsI (BpiI) 线性质粒并连接寡核苷酸（2小时）。
转化最终产物（1天）。
挑选菌落并验证每个菌落的序列（1天）。
接下来
您可以通过脂质体转染或电穿孔递送 PX330。或者，您可以使用 lentiCRISPRv2 作为病毒转导的载体。
方法 2：体外转录 gRNA(见图1)
优点
如果细胞难以转染或不分裂，当 gRNA 以 mRNA 形式存在时，递送效率通常比以质粒形式更高。
RNA 的寿命较短。因此，如果以 mRNA 形式递送 gRNA 和 CRISPR Cas9蛋白，它们会迅速降解，不会被子细胞继承。
缺点
如果您以前从未处理过 RNA，您可能需要一些练习才能获得高质量的 RNA。
没有筛选方法可用于筛选具有 gRNA 和 Cas9 的细胞。
协议
订购寡核苷酸以合成 gRNA。
体外合成 gRNA 作为 mRNA（6小时）。
纯化并验证 mRNA 的质量（2小时）。
接下来
mRNA 可以通过脂质体转染或电穿孔递送到细胞中。如果您决定以 mRNA 形式递送 gRNA，可能还要考虑以 mRNA 或蛋白质形式递送 Cas9。在某些细胞中，以 mRNA 或蛋白质形式递送 Cas9 可以提高产生基因敲除的效率。
总结
现在您已经了解了将 gRNA 合成为质粒（方法1）或 mRNA（方法 2）的优缺点。我们总结了一些常见细胞系的研究人员尝试过的 gRNA 形式和递送方法。插入缺失频率（indel 频率）可以作为 gRNA 和 CRISPR/Cas9 递送效率的一个参考指标。
合成 gRNA 之后，就该将 gRNA 和 CRISPR/Cas9 递送到您的细胞中了！
在接下来的文章中，我们将讨论如何将 gRNA 和 Cas9蛋白 递送到细胞中。
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