在CRISPR Cas9基因编辑中，gRNA的设计对实验的成功影响很大。CRISPR Cas9蛋白在向导RNA，gRNA的指引下，靶向目的基因，并形成双链DNA断裂DSB。由于DSB的不完全修复而产生插入和缺失indels，引起移码突变，导致终止密码子提前，实现编码基因敲除的目的。但是，很多人在设计gRNA的时候会遇到很多困难。针对一些常见的gRNA设计的问题，美格君就和大家一起讨论。
gRNA设计常见问题：
从理论上来说，单gRNA只能靶向基因的1个位点，敲除的转录本数量有限，脱靶率比较高；而双gRNA可以在很大程度上解决这两个问题，也能实现较大的基因片段敲除，因此双gRNA载体的敲除效果会比单gRNA载体好。但是在实际操作中，还要具体情况具体分析，提前制定合适的实验方案，才能在最少的预算中得到想要的实验结果。
设计gRNA时需要考虑很多因素，其中有三个必须要遵守的规则：
1. gRNA的序列特异性要足够强；
2. gRNA序列要尽量覆盖较多的转录本；
3. 避免编码氨基酸的靶向区域过于接近蛋白质的N端或C端。
一个好的gRNA设计软件可以大幅提高我们的工作效率，减少试错成本。市场上有很多gRNA设计软件，其中张峰实验室的sgRNA设计网站是一个很好的选择。
提高gRNA打靶效率的方法有很多, 这包括：
1. 优化从gRNA的序列
2. 改变gRNA载体的传递方式，
3. 增加gRNA的数量等等。
提高gRNA的打靶效率要结合具体情况进行优化处理。
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