CRISPR Cas13结合光刻机技术, 实现快速病毒检测
图1.
上一篇文章提到Rikiya Watanabe团队设计了一种基于CRISPR的无需扩增RNA检测的SATORI方法。
想阅读上篇文章？请点击：无需扩增的CRISPR Cas13 RNA病毒检测技术
SATORI是怎么构建的呢？
Rikiya Watanabe团队的构想非常巧妙。SATORI采用了光刻技术，制作了精密的微腔阵列器件，达到了分子检测的标准。
利用光刻技术制作微腔阵列器件
采用常规光刻技术在薄玻璃基片上制备疏水性通孔结构。
用32 毫米 × 24 毫米盖玻片孵育过夜，然后在8 N KOH溶液中，用超声处理1小时，用纯水冲洗，并用吹风枪干燥。
在这个玻璃上，全氟聚合物（9%的CYTOP，AGC）以每分钟1000rpm或者4000rpm的转速，旋转涂膜30秒、 然后在80°C烘烤10 分钟，180 °C烘烤1小时。
CYTOP层厚度为1.6μm或0.6 μm，用激光显微镜（VK-X1100，Keyence）测定。
正性光刻胶（AZ P4620，AZ电子材料公司）在CYTOP层上，以每分钟7500rpm的转速，旋转涂膜30秒、 然后在100°C，处理5 分钟。
在25℃、60%的湿度条件下，将光刻胶再水化5分钟之后，使用光刻机（PEM-800，Union，图2）和1μm孔的铬光掩模，将玻璃暴露在UV光下，然后用显影剂（AZ300 MIF，AZ电子材料）造影1.5 分钟。美格君发现，Rikiya Watanabe团队用来开发产品的这款光刻机居然是2004年的“老”产品，令人敬佩。
图2. 这是2004年产的PEM-800光刻机
用干法刻蚀机（DES-101E，YAC）和O2 plasma 除去裸露者光刻胶的CYTOP。
通过用丙酮acetone，异丙醇和纯水连续冲洗，除去剩余的光刻胶，完成微室装置的制造。用上述激光显微镜评估装置的质量。
选择孔径为2.5±0.2μm的器件，用于我们的实验。
通过将U形框架腔室密封件（SLF0601，Bio-Rad）和带有入口端口（Tsubaki glass Kogyosyo）的定制玻璃块连接在装置上，构建流动池。
CRISPR Cas蛋白制备
用pET-LwaCas13a蛋白质粒转化大肠杆菌Rosetta 2（DE3，可以利用Magigen LwCas13a蛋白），在37 °C、100 mL TB培养基中，添加氯霉素和卡那霉素，进行培养。
当OD600达到0.6-0.8时，细菌培养物在冰上冷却10 分钟，然后在20 °C，和0.mMIPTG, 继续培养20小时。
收集大肠杆菌细胞，悬浮于5 mL缓冲液A（20nM盐酸三辛酯Tris-HCl （pH 8.0），1 M NaCl和20 mM咪唑），并用超声仪（Q500，QSONICA）破碎。
在15000rpm转速离心15分钟后，将上清液加载到用缓冲液A平衡的Ni-Sepharose High Performance column （GE Healthcare）上。
蛋白用用缓冲液B（20 盐酸三辛酯（pH 8.0），300 mM NaCl，and 400 咪唑）洗脱 。
将该蛋白载入 HiTrap Heparin HP column (1 mL; GE Healthcare)，用缓冲液C（20 盐酸三辛酯（pH 8.0）及300 mM NaCl）平衡。
蛋白质以0.3-2M线性改变的NaCl洗脱。通过SDS-PAGE分析级分，并合并峰级分。
根据通过NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific）测量的A280值，测定蛋白质浓度。将纯化的CRISPR LwaCas13a蛋白的等分试样在液氮中快速冷冻，并储存在−80 °C，直到测量。
RNA制备
使用部分双链DNA模板（补充表4），在37℃，用1小时，在体外，用T7 RNA聚合酶转录crRNA或tgRNA（补充表1和2） 。
为了去除双链RNA污染，如前所述，转录的RNA与RNaseIII（New England Biolabs）在37℃温育 30 分钟，然后通过8%天然聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
RNA浓度由NanoDrop分光光度计测量的A260值确定。
SARS-CoV-2（SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-027）在VeroE6/TMPRSS2细胞（JCRB 1819）中生长，该细胞维持在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，Sigma-Aldrich）中。
含有5%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素。使用RNeasy Mini kit（Qiagen）提取SARS-CoV-2的全基因组RNA，并储存在−80 °C直到使用。
SATORI配置
用缓冲区液D（20 mM HEPES（pH 7.5），150 nM KCl，10 nM MgCl2和0.5mM DTT），将纯化的CRISPR LwaCas13a蛋白稀释至1 μM。
CRISPR LwaCas13a（1 μM） 与等体积的crRNA（625 nM）在无核酸酶的水中混合，然后在37℃下孵育 10分钟。
然后将CRISPR LwaCas13a crRNA复合物（4 μL） 加入到实验混合物中（46 μL） ：缓冲区液D，其中包含10 μM FQ reporter（Integrated DNA Technologies，Supplementary Table 3），
500 μM Triton X-100（Nacalai Tesque），20 μM Alexa Fluor公司™ 647 C2 Maleimide（Thermo Scientific）和各种量的tgRNA。
混合物（50 μL） 从玻璃块上的入口端口装载到微室装置上，然后在25℃下孵育 几分钟。该装置设置在共聚焦显微镜（A1，尼康）的电动XY扫描台上，
配备了60× 油浸镜头（NA = 1.40, Apo, Lambda S）及488及640 nm激光器。为了测定SARS-CoV-2的全基因组RNA，将该装置设置在宽视野显微镜（IX71，Olympus）的电动XY扫描台上，
配备20× 干镜头（NA = 0.45）及488及640 nm激光器。然后，使用定制的电移液器（ICOMES），以4 μL/s的速度，将40 μL十六烷hexadecane（296317，Sigma-Aldrich）加载到设备里。
加载后50秒，开始40个阶段位置的荧光平铺成像开始，成像温度是25 °C。
为了检测污染对SATORI的影响，在测试混合液中添加 PBS（10%），病毒转运培养基VTM（70%，SGI）和标准RNA（3 ng/μL、 Qubit RNA BR Standard #2, Thermo Scientific），并进行SATORI测定。
VTM由细胞培养基，牛血清白蛋白，青霉素，链霉素，庆大霉素和两性霉素B组成。对于具有70%VTM的测定，从测定混合物中除去KCl。
为了分析唾液，将10%的唾液在20mM HEPES（pH7.5）的溶液中稀释 ，溶液含10mM MgCl2，20U核糖核酸酶RNase抑制剂（AM2694，Thermo Scientific），
100 mM DTT和1 mM Triton-X100，在金属浴（MyBL-10，AS ONE亚速旺）上加热, 90 °C, 5分钟。 不同量的tgRNA，5μM FQ报告子，
20μM Alexa Fluor™ 647 C2 Maleimide和LwaCas13a crRNA复合物添加到溶液中，并且如上所述进行SATORI测试。
检测样品制备
鼻咽拭子、前鼻拭子和咽喉拭子样本是根据疾病控制和预防中心CDC的方案收集的。
鼻咽拭子和咽拭子样本 在1mL缓冲液D中制备，缓冲液D含100nMDTT和1nM Triton X-100。
对于前鼻拭子样品的分析，从缓冲液D中去除KCl。在90°C加热后 5分钟后，20U 核糖核酸酶RNase抑制剂，tgRNA，10μM FQ报告子，20μM Alexa Fluor™ 647 C2 Maleimide,
和CRISPR LwaCas13a–crRNA复合物添加到样品中，并进行SATORI分析.
对于复合SATORI分析，CRISPR LwaCas13a蛋白（4 μM） 与等量的2.5μM crRNA（crRNA-CoV-N-1、-4或-7）混合，
然后在37℃培养 10分钟。 每个LwaCas13acrRNA复合物（1μL） 加入分析混合物（47μL）中，然后 进行SATORI分析。
反式裂解活性的动力学测定
为了在单分子水平上测量CRISPR LwaCas13a的反式裂解活性，在将十六烷加载到微室装置上后立即开始成像。
每3秒间隔记录单个阶段点的荧光图像 。使用平均荧光强度与FAM浓度的校准曲线，基于每个室中的平均荧光强度，计算切割FQ报告器的数量，并通过激光显微镜（Keyence）测量微腔体积。
为了获得校准曲线，在缓冲液D中加入不含任何猝灭剂的荧光素结合ssRNA(56-FAM/rUrUrUrUrU, Integrated DNA Technology) ，
溶液包含500μM Triton X-100和20μM Alexa Fluor 647，装入微室装置，然后用十六烷密封，并使用与SATORI分析相同的设置进行成像。
在测试缓冲液（20 mM HEPES（pH 6.8），60 mM NaCl，and 6 毫米MgCl 2）中，加入LwaCas13a（45 nM），crRNA（22.5） nM），FQ报告子（125 nM），鼠核糖核酸酶RNase抑制剂（0.5 μL、NEB），
以及不同数量的tgRNA，测试批量反式切割。反应在37°c孵育10 分钟，用荧光酶标仪（SpectraMax ID3，Molecular Devices），每1分钟检测一次荧光，激发波长470 nm，发射波长520 nm。
图3.
数据分析
使用ImageJ/Fiji进行图像处理，包括球差校正，漂移校正，背景扣除和腔室中荧光强度的提取。
ImageJ plugin, Template Matching and Slice Alignment用于漂移校正。
所有的过程都是使用宏程序自动化处理。使用Python和Anaconda3编写程序，分析一系列提取的强度数据.
LOD值定义如下：
用不同浓度的tgRNA获得的输出值被拟合成一条线性曲线（输出值分别对应于SATORI的阳性微腔数和基于荧光读板方法的荧光强度）。
平均值+3 S.D.，做为不含tgRNA的输出值。
确定线性曲线与输出值（平均值+3 S.D.）交汇点的值。
该交汇点的浓度就是LOD。
复合SATORI的理论LOD值
根据单分子测量方式，LOD值被确定为拟合线性回归线和背景平均值的交叉点 + 3 S.D.值，点B（图1g和3c）。阳性微腔数N表示为LOD的函数。
结合靶RNA后，LwaCas13a–crRNA复合物将顺式或反式切割RNA靶标成多个RNA片段。
因此，在含有三种不同cRNAs的LwaCas13a存在的情况下，三种LwaCas13a–cRNA–tgRNA分子由单个靶标RNA分子产生。
因此，具有三个crRNA组合的复和SATORI的理论Nmp为NN1、NN4和NN7之和，如下所示：
其中，LODN1、LODN4、LODN7和LODmp分别是N-1、-4、-7及其组合的LOD值。通过比较系数，LODmp作为LODN1、LODN4和LODN7的函数给出如下。
根据式（3），理论LODmp计算为4.0 ± 1 fM，与实验结果相吻合, 5.7± 2.2 fM（图3c，d）。
统计和可重复性
本文描述的所有测量都是从不同的样本中进行的，所有在纸上进行的实验都成功地重复了三次以上。
参考文献
Amplification-free RNA detection with CRISPR–Cas13
Author: Hajime Shinoda et al
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