无需扩增的CRISPR Cas13 RNA病毒检测技术
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摘要
基于CRISPR的核酸检测是一种新兴的分子诊断技术。然而，这些方法一般需要几十分钟至数小时的时间，扩增提高了检测灵敏度，但是可能导致扩增误差。在这里，我们通过结合基于CRISPR-Cas13蛋白的RNA检测和微室阵列技术，开发了一个允许“基于CRISPR的无扩增数字RNA检测（SATORI）”的平台。SATORI检测到单链RNA靶点，最大灵敏度约为10fM, 时间小于5分钟，特异性高。此外，同时使用多个不同的向导RNA可提高灵敏度，从而能够在~5fM水平上检测SARS-CoV-2 N基因RNA。因此，我们希望SATORI能够成为一个强大的准确和快速诊断方式。
背景
准确快速的核酸检测方法有助于癌症的早期诊断和病毒大流行的预防。目前，由于新型冠状病毒COVID19在全球范围大流行，病毒检测求巨大。在逆转录定量聚合酶链反应RT-qPCR作为一种“金标准”方法被广泛应用的同时，近年来，基于CRISPR的核酸检测，如SHERLOCK和DETECTR，作为一种快速、灵敏的方法引起了广泛的关注。
为了提高检测灵敏度，这些基于CRISPR的扩增方法，要进行靶核酸的预扩增过程，要使用恒温扩增试剂，比如Magigen RDA or TwistDX RPA, 随后通过荧光或比色读出由CRISPR Cas酶，例如CRISPR Cas12a蛋白或Cas13a蛋白介导的检测。需要进行预放大处理，因为基于CRISPR的方法缺乏预放大，需要约30分钟的时间h检测单链RNA，检测限LOD一般大于50pM。预放大过程增加了检测时间（至少几十分钟），并且可能由于放大错误而导致假阴性或假阳性结果。
为了克服这些挑战，日本理化研究所的Rikiya Watanabe团队结合了基于CRISPR-Cas13蛋白的核酸检测系统和微腔(微室)技术，开发了一个称为SATORI（基于CRISPR，无扩增数字RNA检测）的检测平台，可以在单分子水平上准确快速地检测ssRNA。SATORI能够快速灵敏地检测来自SARS-CoV-2的N基因RNA和全基因组RNA，突显了SATORI作为一种强大的快速和强大的病毒诊断新类别的潜力。
图1.
验证结果
用SATORI进行ssRNA 单分子检测
研究人员结合CRISPR Cas13a蛋白介导的RNA检测和微腔(微室)阵列装置开发了SATORI平台。
设备包含超过 1× 106个微小的通孔，飞升级别微腔（体积V~3fL, 直径ϕ = 2.5 μm、 高度h = 0.6 μm） ，从而能够在单分子水平上对化学反应进行大规模平行观察（补充图1）。
事实上，这种微腔(微室)装置促进了高灵敏度和定量生物测定的开发，如数字酶联免疫吸附实验和膜蛋白的单分子分析。
作为一个概念验证实验，研究人员试图用SHERLOCK中使用的wadei Leptotrichia Cas13a（LwaCas13a蛋白）和CRISPR RNA（crRNA），在这个微室装置中检测目标ssRNA（tgRNA）（图1a）。
研究人员将纯化的CRISPR LwaCas13a蛋白与互补于120 nt tgRNA（tgRNA1）的crRNA（crRNA1）预先组装，然后将LwaCas13a–crRNA1复合物添加到含有tgRNA1和荧光团猝灭（FQ）标记的RNA报告物的样品溶液中（补充表1和2）。
他们将混合物装入微室装置中，然后使用荧光显微镜观察来自CRISPR LwaCas13a蛋白介导的FQ报告子裂解的荧光（图1a，补充图2）。
密封装置后，整个阵列的荧光强度显著增加（图1b，c），表明LwaCas13a–crRNA1复合物识别tgRNA1，并在微腔中以反式切割FQ报告物。
实时记录显示，在2分钟内，室中的荧光强度达到了平台稳定期，由于腔体体积小（体积约3 fL）和LwaCas13a蛋白的强劲切割活性（k = 1.1 × 107 × [FQ rep.] M−1 s−1） （图1c、d和补充图3和4），
在SATORI中，几分钟内, 从大约1.2x105个腔室获得了荧光图像 ，总共只需要不到5分钟，这比其他基于CRISPR的方法的时间短得多。
当样品溶液稀释到每室约1:1的tgRNA比例时，阵列中的荧光强度分布不均匀（图1b）。
阳性微腔定义，含有LwaCas13a–crRNA1–tgRNA1复合物的微腔， 平均强度超过2000（背景+ 20 S.D.）的是阳性微腔。
阳性微腔的数量线性增加，这取决于tgRNA的浓度（30 fM至300 pM）（图1e-g）。
这些结果表明，在这些条件下，每个微腔随机含有一个或零个LwaCas13a–crRNA1–tgRNA1复合物，并且每个阳性微腔中的荧光来自单个LwaCas13a–crRNA1–tgRNA1分子的报告裂解。
值得注意的是，SATORI检测到了LOD为56 fM的tgRNA1（参见“材料和方法”），远远低于基于平板阅读器的批量分析的检测限（图1g，补充图5），显示了在微室阵列中进行数字检测的优势。
图2.
为了研究SATORI的特异性，研究人员使用11个crRNAs（crRNA1–11）和3个tgRNAs（tgRNA1–3）检测了crRNA和tgRNA之间的错配对阳性微腔数量的影响，这两种方法在以前的研究中使用（图2a）。
单个错配对阳性腔室的数量没有实质性影响（图2b）。相反，双错配和三错配分别使它们减少了约5倍和约25倍（图2b），而它们不影响荧光动力学（补充图6）。
这些结果表明，错配减少了活性LwaCas13a–crRNA–tgRNA分子的数量，如先前所示的，但不影响CRISPR LwaCas13a蛋白的反式切割活性。
效应取决于错配位置，位置3和位置2、4或5的双重错配具有显著的效应（图2b、c），与之前对SHERLOCK的研究一致，证实了实验的有效性。
图3.
SATORI快速灵敏检测SARS-CoV-2
为了检测SATORI检测SARS-CoV-2的能力，研究人员使用10个crRNA（crRNA-CoV-N-1-10）对SARS-CoV-2 N基因RNA（约1kb）的不同区域进行SATORI测试，美国CDC的 RT-qPCR分析也是靶向这个基因（图3a，补充图7）。
值得注意的是，SATORI检测到SARS-CoV-2 N基因RNA的LOD值为9.3-123 fM（图3c，d）。
这些结果表明，SATORI的效率取决于crRNA引导序列，正如在SHERLOCK中观察到的那样。
在靶向RNA结合后，LwaCas13a–crRNA复合物将顺式切割或反式切割 RNA靶标成多个RNA片段。
因此，同时使用与靶RNA不同区域互补的多个crRNAs，可从单个靶RNA分子产生多个LwaCas13a–crRNA–tgRNA分子，从而增加阳性微腔的潜在数量（图3b）。
为了验证这一假设，研究人员同时使用了三种crRNAs（crRNA-CoV-N-1、-4和-7），它们在所测试的crRNAs中表现出最高的敏感性，N-1、-4和-7的LOD值分别为9.3±3.8, 18.0±8.2和11.4±4.7 fM。
实际上，同时使用这三种crRNAs导致LOD值为5.7 ± 2.2 fM（3.4 × 106 copies/mL）（图3c，d），与理论值（4.0±1.0 fM）一致。（“材料和方法”）
图4.
为了检验SATORI对临床样本的适用性，研究人员使用从日本爆发新冠病毒的“钻石公主”号游轮上分离出的SARS-CoV-2病毒全基因组RNA（约30kb）进行SATORI 检测。
研究发现，SATORI用crRNA-CoV-N-1检测SARS-CoV-2基因组RNA，LOD为12.8 fM（图4a），可对比的是N基因RNA片段的LOD值9.3 fM。
他们还研究了SATORI是否受到污染物的影响，如病毒转运介质、唾液、鼻咽拭子、前鼻拭子、咽拭子和非靶向RNA，这些污染物在临床标本中大量存在，并影响传统的qPCR和其他基于CRISPR的方法。
在这些污染物存在的情况下，观察到几乎相同数量的阳性微腔（图4b），这表明SATORI与原始临床标本的相容性。总之，这些结果表明SATORI在SARS-CoV-2诊断中的潜力。
讨论
在本研究证明了SATORI是一个准确、快速、强大的ssRNA检测平台，与其他ssRNA检测方法相比，它具有一些技术优势。
第一，与传统的基于PCR的方法不同，SATORI不受扩增错误的影响，因为它在单分子水平上计算目标RNA分子的数量。
第二，SATORI需要更少的时间，小于5 分钟，其他他方法大于30分钟。
第三，SATORI对唾液等污染物的抵抗力更强，这表明SATORI具有在无需RNA纯化过程的情况下直接应用于临床样本的能力。
此外，SATORI能够容忍引导序列和目标序列之间的单一错配，正如其他基于CRISPR的方法（例如SHERLOCK）所报道的那样。
这种错配耐受可能有利于检测ssRNA病毒，因为它可能获得点突变。
因此，SATORI可用于对ssRNA病毒（如SARS-CoV-2、HIV、寨卡病毒、埃博拉病毒和流感）的感染进行更快速、更有效的初步筛查，与当前的抗原检测相结合，然后进行更准确但耗时的qPCR检测。
此外，SATORI与CRISPR/Cas12a蛋白结合可实现无扩增双链DNA的检测，可用于DNA病毒感染的诊断和循环肿瘤DNA的检测。
结果表明, SATORI的灵敏度（LOD为5.7 fM, 3.4×106 copies/mL)，相比于其他无扩增CRISPR方法（约50 pM，约3 × 1010 copies/mL）和抗原测试(约17 fM，1.0 × 107 copies/mL），SATORI方法的灵敏度分别要高出约104倍和3倍。
这些观察结果表明，与其他基于扩增的方法比较，虽然SATORI的灵敏度比其他基于扩增的方法低103倍，如SHERLOCK（~ 2 aM, ~ 103copies/mL )，DETECTR（~ 20 aM, 约104copies/mL 和qPCR（~ 2-20 aM,~ 103-104 拷贝/mL），SATORI有足够的灵敏度，可以检测大多数患者临床标本中的SARS-CoV-2 RNA（平均约106-109拷贝/mL）。
在本文的修订过程中，Fozouni等人报道了一种基于CRISPR Cas13a蛋白的无扩增RNA检测方法。与Rikiya Watanabe团队研究结果一致，他们发现多种crRNA的组合提高了CRISPR Cas13a蛋白介导的RNA检测的灵敏度，并在感染患者的临床标本中检测到SARS-CoV-2 RNA。
但是，他们的方法与SATORI之间存在显着差异。Fozouni等使用Leptotrichia buccalis Cas13a（LbuCas13a蛋白）并在384孔板中进行荧光测量。
相反，Rikiya Watanabe团队使用CRISPR LwaCas13a蛋白、并在单分子水平的微室装置中检测荧光信号。
通过使用LbuCas13a蛋白而不是LwaCas13a蛋白，以及同时使用更多更有效的crRNA来检查是否可以进一步提高SATORI的敏感性将是值得探讨的。
此外，如其他方法所报道的，通过优化样品浓缩步骤可以提高测定灵敏度。
SATORI在成本和可扩展性方面的优点将在临床实验室中实用。
SATORI目前的成本约为9.10美元（制造一个微室为5.20美元，试剂为3.90美元）（补充表5和6），与qPCR和抗原检测相当（1.21-4.39美元）。
Vogels等人开发了SalivaDirect，一种廉价的基于唾液的无核酸提取qPCR方法，并证明唾液是SARS-CoV-2诊断的有效标本。
鉴于SATORI不受唾液存在的抑制，它有可能进一步降低成本。此外，SATORI的成本可以通过微室设备的大规模生产来降低。
Rikiya Watanabe团队使用一台装有20倍物镜的普通广角荧光显微镜，并使用免费提供的软件工具“ImageJ软件”分析图像（图4）。
因此，如先前报道的那样，可以使用紧凑便携式荧光显微镜来实现SATORI相对容易。
这些功能支持SATORI在临床实验室中的未来可扩展性和实用性。鉴于这想研究的发现，美格君认为SATORI有可能成为未来诊断的一种新型技术。
SATORI平台是怎样构建的呢？
Rikiya Watanabe团队在构想SATORI产品的时候，使用了当今大热的光刻机技术，想知道光刻机技术如何跟CRISPR Cas13蛋白结合，开发快速检测产品？请继续点击阅读下文：
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