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CRISPR Cas12a的切割原理一

thomas

2021-04-03

CRISPR/Cas蛋白

大家好，我是托马斯，应美格君的邀请，今天想讲一下crispr cas12a的切割原理。CRISPR Cas12a在最近的快速检测应用中崭露头角。

那么crispr cas12a是怎样工作的呢？

CRISPR Cas12a切割原理

大家都已经非常熟悉crispr Cas9这个强大的基因组编辑工具，但其除了crispr cas9这个基因编辑工具以外，还有一些非常出色的Cas核酸酶编辑工具。V型crispr cas12a蛋白，以前称为Cpf1，就是一个很好的例子。尽管crispr cas12a蛋白的开发比Cas9蛋白晚了几年，但是crispr Cas12a蛋白有一些特别的优势，可用于某些特定的应用。crispr Cas12a最常用的变体之一是来自Acidaminococcussp.BV3L6的酶，AsCas12a蛋白。与crispr Cas9蛋白一样，Cas12a蛋白目前已被广泛应用于包括细菌、酵母、植物和人类细胞在内的许多物种。

crispr cas12a作为一种2类核酸酶，是一种向导RNA引导的双链dna(dsDNA)断裂的多结构域蛋白。与crispr cas9蛋白一样，crispr cas12a蛋白结构可细分为REC和NUC叶（图A）。

图A. crispr cas12a蛋白域结构

crispr cas12a蛋白的NUC叶缺少HNH结构域，但含有RuvC结构域，用于DNA切割。此外，NUC叶有一个楔形结构域和一个“核酸酶”（NUC）结构域，这两个结构域不能切割DNA。crispr AsCas12a蛋白有1307个氨基酸长，几乎和crispr SpCas9蛋白一样大。

与crispr cas9蛋白不同，crispr cas12a蛋白不需要tracrRNA进行pre-crRNA加工，也不需要RNaseIII。然而，其他V型核酸酶，例如CRISPRCas12b蛋白，确实需要tracrRNA。CRISPR Cas12a在WED结构域中具有核糖核酸酶位点，其允许将pre-crRNA自主形成成熟的crRNA。CRISPR Cas12acrRNA明显短于CRISPR Cas9向导RNA（sgRNA或crRNA++tracrRNA）。概括的来说，这允许紧凑的Cas12a CRISPR阵列，可用于同时靶向多个位点。一旦与CRISPR Cas12a蛋白结合，crRNA的重复衍生部分就采用5'伪结构。在crRNA的间隔区衍生部分内，PAM近端（种子）区域通过与蛋白质的相互作用，预先排序，暴露这些核苷酸，用于与DNA靶链的碱基配对相互作用。

图B crispr cas12a切割原理图

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试剂盒名称	编码	容量大小	试剂价格
Magicscript 耐热逆转录酶 II	A001S	100µl, 200U/µl	498
Magicscript RNA酶抑制剂	A002S	100µl, 40U/µl	320
Magicscript 耐热逆转录酶 III	A003S	100µl, 200U/µl	1580
Rnase H（E.coli）	A004S	250U	320
一步法RT-qPCR预混液II	A014S	100T	798
抗体修饰热启动 Taq 1.0 DNA 聚合酶（带基础 buffer）	A016S	250U, 5U/µl	385
Taq 1.0 DNA 聚合酶（带基础 buffer）	A015S	250U, 5U/µl	190
化学修饰热启动 Taq 1.0 DNA 聚合酶（带基础 buffer）	A017S	250U, 5U/µl	385
CRISPR Cas12a (Cpf1)	C001S	70pmol/盒	580
CRISPR Cas9	C002S	70pmol/盒	489
CRISPR Cas12b	C006S	100pmol/盒	1480
CRISPR Cas13a	C005S	100pmol/盒	1280
CRISPR Cas14a	C015S	100pmol/盒	1280
T7 Endonuclease I	C007S	250U/盒	549
单链DNA荧光报告探针	C009S	50 test	139
单链RNA荧光探针	C011S	50 test	239
耐热 Rnase HII	A006S	250U	1299
2X LAMP Amplication Mix（with dye）	F001S	50T	1299
鼠尾基因型鉴定试剂盒	A010M	100次	498