基于CRISPR-Cas12和LAMP的新冠病毒快速等温检测技术
如何利用CRISPR Cas蛋白开发快速检测产品系列1
近日，来自美国加州大学的Charles Y. Chiu及同事开发了一种基于CRISPR-Cas12蛋白的快速检测SARS-CoV-2的方法，该方法称为针对SARS-CoV-2病毒的DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter）的病毒传感器。
该方法使用环介导等温扩增RT-LAMP技术，对从鼻咽或口咽拭子中提取的RNA进行反转录和等温扩增，然后利用Cas12蛋白检测设定的冠状病毒序列。
研究人员首先设计了针对SARS-CoV-2的包膜E和核蛋白N的引物（图1a）。
引物扩增区与世界卫生组织WHO测定的E基因区域和美国CDC测定的N基因中的N2区域重叠，但经过修改以满足LAMP的设计要求。
没有针对美国CDC分析使用的N1和N3区域，因为这些区域缺乏适合Cas12先导RNA（gRNA）的位点。
接下来，研究人员设计了Cas12 gRNA来检测在E基因中的三种新冠病毒SARS-CoV-2，bat-SL-CoVZC45和SARS-CoV，特异性地仅检测到N基因中的SARS-CoV-2。
该设计类似于WHO和美国CDC分析所使用的设计，其使用多个扩增子，携带对SARS-CoV-2有特异性或能够鉴定相关SARS类似冠状病毒的探针。
在无核酸酶的水中，利用合成的体外转录SARS-CoV-2 RNA基因靶标，这个基于CRISPR-Cas12蛋白的检测可以区分与采用E基因gRNA的相关新冠病毒没有交叉反应的SARS-CoV-2，与预期跟E基因gRNA有交叉反应的SARS-CoV-2。
然后，实验优化了针对E基因的SARS-CoV-2 的病毒传感器DETECTR，N基因和人RNase P基因作为对照，构成了 62°C、持续20-39分钟的RT–LAMP反应，Cas12检测反应在37°C，持续10分钟。
DETECTR检测运行大约30-40分钟，在侧流条上显示出结果（图1c，d）。
如果E和N基因都可以检测到，则SARS-CoV-2 DETECTR测定被认为是阳性的，如果E或N基因有一个被检测到，则有可能是阳性（图1e）。
这种解释与目前美国FDA EUA指南一致。
使用FAM-生物素报告分子和设计用于捕获标记的核酸的侧向流动条，实现了Cas12检测反应的可视化。
未切割的报告分子在第一条检测线（对照线）处被捕获，而随意的Cas12蛋白切割活动在第二条检测线（测试线）处产生信号。
为了比较使用荧光或侧流时Cas12蛋白产生的信号，采用了RT–LAMP等温扩增反应，利用5-fM or 0-fM IVT模板，N基因引物，使用荧光读数器监测相同扩增子上Cas12的性能，利用侧流条观察在 0, 2.5, 5和10分钟时的反应。
在1分钟内就检测到Cas12蛋白荧光信号，在5分钟内就显示了侧流信号。
研究人员比较了RT-LAMP/Cas12-DETECTR荧光检测的分析检测限LoD。
与美国CDC qRT-PCR分析相比，DETECTR侧流分析可以轻松显示是否有病毒的存在。
由加利福尼亚公共卫生部测试的CDC测定的估计LoD为每μl反应1个拷贝，这与美国FDA包装说明书中的分析性能一致，而DETECTR测定为每μl反应10个拷贝。
然后，研究人员评估了RT-LAMP检测直接从原始样品中扩增SARS-CoV-2核酸的能力，这些原始样品来自无症状患者的鼻咽拭子，这些样本置于UTM或磷酸盐缓冲盐水中，并加入SARS-CoV-2 IVT靶向RNA。
在≥10%UTM和≥10%磷酸盐缓冲盐水反应浓度下，测定性能降低，预计的LoD分别降至15000和500拷贝/μl。
接下来使用基于荧光和侧向流动条读数的SARS-CoV-2 DETECTR， 测试了来自6例PCR阳性COVID-19患者的11份呼吸道拭子样本中提取的RNA，和5例来自流感患者和常见人类季节性冠状病毒感染的12个鼻咽拭子样品提取的RNA。
在11个COVID19患者拭子中的9个中检测到SARS-CoV-2，并且没有与其他呼吸道病毒交叉反应。来自COVID-19患者的两个阴性拭子被证实病毒含量低于规定的LoD。
鉴于侧流和基于荧光的读数之间的高度一致性，采用荧光读数，研究人员使用DETECTR测定法，盲测来自SARS-CoV-2染患者的另外60个鼻咽拭子样品。
在60个样本中，有30个通过qRT-PCR检测，COVID-19呈阳性，有30个COVID-19呈阴性。
相对于CDC qRT-PCR检测，SARS-CoV-2 DETECTR的阳性和阴性一致性分别为95%和100%。
DETECTR分析具有与qRT-PCR相当的准确性。
然而，与qRT-PCR相比，DETECTR方法的优势包括等温信号放大，无需热循环，快速，单核苷酸靶标特异性，快速检测，易于使用，无需复杂的实验室设备。
目前比较常用的恒温扩增技术除了LAMP外，还有twist RPA, Magigen RDA技术。随着等温扩增技术的日益成熟，越来越多的等温技术产品进入临床应用，用于病毒检测、病原体检测。
参考文献
CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2
James P. Broughton, Xianding Deng, Guixia Yu, Clare L. Fasching, Venice Servellita, Jasmeet Singh, Xin Miao, Jessica A. Streithorst, Andrea Granados, Alicia Sotomayor-Gonzalez, Kelsey Zorn, Allan Gopez, Elaine Hsu, Wei Gu, Steve Miller, Chao-Yang Pan, Hugo Guevara, Debra A. Wadford, Janice S. Chen & Charles Y. Chiu
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