对垃圾填埋场聚乙烯废料细菌定殖情况的研究
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摘要
塑料废弃物在海洋环境中的微生物定殖已经得到了广泛的研究，而对老化的陆地废弃物的研究却很少，且大多局限于塑料降解微生物的分离。
这里，我们应用了多学科的方法，包括培养组学、NGS下一代测序分析和精细的物理化学测量，来描述垃圾填埋场回收的35年以上的塑料废物，并评估在薄膜表面作为生物膜生长的细菌群落的组成。
所有样品均采用不同的颜色进行表征，但均为聚乙烯；IR和DSC分析确定了不同程度的降解，而FT-Raman光谱和x射线荧光进一步评估了降解程度和色素的存在。
每种塑料类型都有不同的细菌群落，这与物理化学分析所强调的差异一致。此外，通过α-和β-多样性NGS分析发现，降解程度最高的聚乙烯薄膜所寄主的细菌群落与周围土壤更为相似。
这项工作证实了一个新的假设，即不同的聚乙烯地面废物样本可有不同的细菌群落，这些群落的结构与塑料的物理化学性质（包括降解程度）相关。
介绍
塑料材料对环境的污染是一个全球性的问题。近期数据显示，全球塑料材料产量持续增长，从2015年的322吨增至2016年的3.35亿吨。尽管过去几年塑料回收率有所上升（2016年为40.9%），但塑料在填埋场倾倒或处置不当的比例仍超过全球年产量的1/5。
大多数塑料属于对降解过程有很强抵抗力的化学类别：聚乙烯PE、聚丙烯PP、聚苯乙烯PS和聚氯乙烯PVC。
大量证据表明，即使是最难降解的塑料，也可以通过激活特定微生物，与几种降解细菌和真菌一起，进行部分代谢。
最近在聚对苯二甲酸乙二醇酯PET方面取得了重大突破，从倾倒区分离的一种细菌Ideonella sakainensis中分离出一种高效降解酶，并对其进行了表征，而对于最丰富的塑料PE，降解的证据仍然非常有限（高密度聚乙烯HDPE小于10%），完全降解机制仍在研究中。
塑料材料的微生物生态学研究不仅是分离和鉴定具有潜在降解能力的菌株的基础，也是了解塑料材料对环境的影响的基础。
研究主要集中在水环境中收集的塑料废弃物上，关注聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯表面的生物膜与周围水体微生物群落的不同，而塑料类型对微生物组成也有影响。
另一方面，虽然最近有证据表明土壤中含有丰富的塑料，但对土壤环境的研究很少。据估计，欧洲和北美每年向农田中添加的塑料超过30万吨，而分析测量表明，在靠近工业区的土壤中，微塑料的浓度高达6.7%。
蚯蚓也可以通过土壤运输微型塑料，但它们对土壤质量生态的影响还不清楚。Machado等人研究了聚乙烯对土壤生物物理性质的影响，发现塑料降低了土壤容重，提高了土壤微生物活性。
人们还发现，聚乙烯可以影响有机污染物的作用和迁移：对于疏水性化合物，如多环芳烃PAH，生物可利用率和对微生物的毒性降低，以及它们的生物降解，当对于更极性的农药吸附减少，迁移率比土壤颗粒增加。
塑料污染中需要考虑的另一个重要方面是其作为病原菌载体的可能作用：这一点没有在土壤环境中得到解决，而只在水生环境中得到解决，例如在北海和波罗的海，人们发现聚乙烯塑料有选择性地富集了弧菌物种，包括致病性副溶血性弧菌。另一方面，在垃圾填埋场和其他陆地上进行的几项研究，集中在聚乙烯降解菌株的分离和鉴定上，但是，据我们所知，对塑料垃圾上生长的细菌群落的全面评估仍然缺乏。
为了填补这一空白，我们对35年前关闭的旧垃圾填埋场的不同塑料垃圾进行了取样。
采用红外光谱IR、拉曼光谱、差示扫描量热分析DSC、扫描电镜SEM和x射线荧光XRF对样品进行了结构表征。
在微生物学水平上，用illumina的扩增子测序和平板培养分离，评估生活在塑料上的细菌群落结构。对填埋场土壤和邻近的未污染土壤进行了细菌群落的分子分析比较。
本研究的主要假设是：
（i）针对不同的细菌群落选择不同类型的塑料；
（ii）细菌群落的结构可能与塑料的物理化学性质（包括降解程度）相关。
结果
塑料取样和特性
从垃圾填埋场回收了五种不同的塑料袋废物，这些垃圾从1982年以来就被废弃了。
塑料样品用颜色进行表征，标记为黑色（B）、白色（W）、红色（R）、绿色（G）和黄色（Y）。每种彩色塑料回收三种不同的薄膜，并对这些重复品进行三次微生物和材料分析。
用红外光谱和差示扫描量热法对塑料样品进行了表征。
采用FT-Raman光谱和x射线荧光光谱对聚合物中的色素进行了表征。
扫描电子显微镜也用于检查机械剥离生物膜之前和之后的塑料。
聚乙烯相关菌群的分子分析
微生物分析通过培养和分子方法进行，采用一种从塑料样品中提取生物膜的通用方法。
用FastDNA SPIN Kit试剂盒提取土壤DNA，并用标记引物对16S rRNA的v3-v4区进行PCR扩增。用Illumina Miseq对所有扩增子进行测序。
对所有被分析的OTU的相对丰度进行的多元主成分分析PCA, 显示了样本之间的强烈差异（图1）：每种塑料有不同的细菌群落，一边是绿色和黄色，另一边是黑色和白色。
图1
在塑料和土壤样品之间发现了红色塑料细菌群落；最后，后者彼此非常接近，但仍分为两组（填埋土和对照土）。
通过对在属（图2a）和种水平（图2b）分类的序列进行分层聚类分析，证实了细菌群落的这种分化。
属级分析（图2a）显示，与土壤相比，在塑料样品上分类为芽孢杆菌的序列显著富集。
图2
在对照土壤中，平均检测到1.9%的芽孢杆菌序列：该属在弃土中的相对存在率增加到3.2%，在红塑料中的相对存在率增加到9.6%。
黄色塑料的含量达到22.4%，绿色塑料为24%，黑色和白色塑料分别达到47.2%和57.5%。
与土壤相比，塑料样品上的其他属显著高于土壤：黄色和绿色塑料上的庞蒂巴菌，分别为15.6%和2.2%，而土壤中的平均值为0.2%，
黑色、白色和红色塑料中的梭菌，分别为7.6%、5.4%和3.5%，而土壤中的平均值为2.0%。
结果表明，土壤中的塑性是由少数优势种定植的。
垃圾场污染土壤中的细菌多样性显著高于邻近未污染土壤。当塑料样品按颜色区分时，细菌指标进一步出现显著差异。
芽孢杆菌是塑料废弃物主要的定居者。
对属级16S PCR扩增子的分析（图2b）表明，所分析的所有塑料样品均具有较高的芽孢杆菌序列相对丰度，最高可达白色塑料总属的57.5%。
因此，分析的重点是细菌的相对丰度，可以在物种水平上识别和分类。
图3
图3显示了检测到的10种最丰富物种的结果：除1种（第二种最丰富）外，所有物种都在物种级别上正确分类。
图3a所示的结果证实，与对照土壤和弃土相比，塑料上的所有芽孢杆菌种类都显著增加。
最丰富的是硒化芽孢杆菌Bacillus selenatarsenatis，其次是坚实芽孢杆菌Bacillus firmus、马里斯夫拉维芽孢杆菌Bacillus marisflavi、霍利科希芽孢杆菌Bacillus horikoshii、穆拉利斯芽孢杆菌Bacillus muralis、富马里奥芽孢杆菌Bacillus fumarioli、福氏芽孢杆菌Bacillus flexus和柯氏芽孢杆菌Bacillus cohnii。
当数据按塑料类型分类时，我们发现，即使这些非常丰富的芽孢杆菌物种的相对分布也受聚乙烯袋废物的颜色控制（图3b）。
特别是，B. selenatarsentis和B. marisflavi在白色和黑色塑料上更为丰富，而B. firmus、B. horikoshii和B. cohnii仅在白色塑料上占优势。
黄色塑料具有不同的芽孢杆菌群落结构，优势种为壁芽孢杆菌、福氏芽孢杆菌和弯曲芽孢杆菌。
值得注意的是，红色塑料具有更高的降解水平，细菌群落更接近土壤，这些芽孢杆菌物种的相对丰度也更低。
从塑料表面分离可培养细菌
从塑料中提取相同的生物膜样品，并对其进行16S rRNA PCR扩增，用于分离可培养细菌。
为了关注对塑料有亲和力的物种，而不是全部细菌群落，我们选用的基本培养基以石蜡为唯一碳源，后者作为模型分子，用于选择具有潜在聚乙烯降解能力的菌株。
将稀释液稀释至小数点，选出代表性菌落，连续三次传代纯化，经RAPD分析，最后用PCR扩增产物的Sanger测序进行鉴定。
参考文献
Selective bacterial colonization processes on polyethylene waste samples in an abandoned landfill site
Edoardo Puglisi, Francesco Romaniello, Serena Galletti, Enrico Boccaleri, Alberto Frache & Pier Sandro Cocconcelli
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