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口腔细菌在悉生小鼠体内的定植和与肠道微生物群的竞争

Xuedong Zhou

2019-03-05

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口腔微生物群与口腔疾病和消化系统疾病有关。然而，两者之间的因果关系还没有未完全清楚，由于现有研究模型的局限性，口腔细菌对肠道的定植情况也不清楚。

口腔微生物群与口腔疾病的联系

临床试验表明，口腔微生物群与龋齿和牙周炎有关，这两种疾病都会导致老年人牙齿大量损失，在世界范围内都是是公共卫生问题。

越来越多的证据甚至将人类口腔微生物群与口腔癌联系起来。近年来，口腔微生态发育不良已被证实可引起牙周炎，并被视为预测幼儿龋齿（ECC）的指标。

口腔微生物群在口腔疾病的发生中起着关键作用。

越来越多的口腔微生物群临床研究正在设计中。然而，临床调查通常受到复杂条件的限制，包括伦理问题。

无论如何，一项前瞻性临床研究发现，在ECC临床症状出现之前，微生物群会发生变化。

口腔微生物群与消化系统疾病的联系

口腔细菌不仅与口腔疾病有关，也与各种消化系统疾病有关，包括炎症性肠病、结直肠癌、胰腺癌、肝癌和肝硬化等。

比较肝硬化患者和健康对照组的肠道微生物群，结果发现，大多数（54%）病人粪便微生物种类源于口腔，表明口腔微生物群侵入了肝硬化患者的肠道。

这些研究表明，口腔微生物群通过入侵和定居肠道影响宿主健康。口腔微生物群在肠道的定植是了解病理定植的关键，有助于研究口腔细菌在系统性消化疾病中的致病机制。

但是，大多数其他研究都是横向的，几乎不能说明口腔微生物群是口腔疾病发展的原因还是结果。

由于口腔中有大量未培养的系统类型，体外模型有局限性。动物模型被认为是研究口腔微生物群的好选择；小鼠的口腔微生物群是最常见的实验动物模型，但它不同于人类。

本研究的目的是通过建立人类口腔微生物群相关的小鼠模型HOMA，研究其对肠道的生态入侵。通过将人唾液移植到无菌GF小鼠体内，初步建立HOMA模型。

采用16S rRNA基因测序技术对口腔细菌沿整条消化道的生物地理学进行了研究。在Homa小鼠中，84.78%的属级分类群对供体具有特异性。

主成分分析（PCA）显示供者口腔微生物群与HOMA小鼠的菌群聚集在一起，并且与特定的无病原体SPF小鼠不同。

在Homa小鼠中，从胃和小肠到远端肠道的OTU计数下降。远端肠道以链球菌、韦荣球菌、嗜血杆菌、梭杆菌、毛球菌和放线菌为主。

然后将HOMA小鼠和人类微生物群相关HMA小鼠以及GF小鼠一起寄养。寄养小鼠的微生物群落聚集在一起，并与HOMA小鼠和HMA小鼠的微生物群落显著分离。

来源追踪分析和网络分析显示，与寄养小鼠的远端肠道相比，口腔细菌对小肠的生态入侵更为显著。

为了建立HOMA小鼠模型，我们将人类唾液微生物群引入到GF小鼠中，并建立了一个定义明确、具有代表性的人类口腔微生物生态系统动物模型。

利用HOMA小鼠模型，我们研究了肠道中选择的口腔细菌沿纵轴的定植情况。

此外，我们还研究了口腔微生物群与肠道不同区域的本地肠道微生物群的竞争，并通过与HOMA小鼠、HMA小鼠和gf小鼠共孵育，确定了生态入侵过程中的关键细菌（图1）。

研究结果显示：

HOMA小鼠模型的口腔微生物群

对口腔样本的调查显示人类口腔微生物群的植入：在受试小鼠中检测到所有细菌门、类、目、28个细菌科中的27个和属级分类群中的84.78%（46个分类群中的39个）。

人源化小鼠缺失的7个属级分类群在供者样本中均表现出低丰度（平均0.21%）。供者口腔微生物群以11个属级分类群为主，相对丰度较高（>1%），

其中5个属级分类群，维氏菌、梭杆菌、链球菌、卟啉单胞菌和嗜血杆菌在受者小鼠中保持较高丰度（>1%）。其他的在受体小鼠中被耗尽至低丰度。

为了进一步确定HOMA小鼠模型的优点，我们比较了HOMA小鼠和SPF小鼠的口腔微生物群。

PCA显示供者口腔微生物群与HOMA小鼠紧密聚集，但与SPF小鼠微生物群不同，尤其是PC1（57.91%）中（图2a）。

图2

HOMA小鼠口腔微生物群的分类结构与SPF小鼠不同。Homa小鼠唾液样本中的优势属水平分类群明显比SPF小鼠丰富，包括韦荣球菌、梭杆菌、链球菌和嗜血杆菌（图2b，c）。

宿主肠道口腔微生物群的生物地理学

16S rRNA基因测序调查显示，口腔细菌在肠道的各个部分定居。

全肠主要属级分类群为链球菌、面纱菌、嗜血杆菌、梭杆菌、毛球菌和拟杆菌。

虽然不同地区的微生物群落共有一些主要细菌，但它们之间的差异是明显的。主坐标分析（PCOA）显示，盲肠、结肠和粪便中的微生物群落聚集在一起，与胃和小肠中的微生物群落不同。

从胃和小肠到远端肠道以及从盲肠到粪便的OTU计数显著下降。远端肠道群落被耗尽。

从胃和小肠到远端肠道和粪便，不动杆菌、肠杆菌科未分类杆菌、乳酸杆菌、尿杆菌、变形杆菌属未分类杆菌和莫拉西拉菌的相对丰度下降。

从盲肠和结肠到粪便，副杆菌类、腔隙杆菌和布劳氏杆菌的相对丰度降低。这些结果表明，口腔细菌被远端肠道过滤。

口腔微生物群对肠道的生态入侵

PCOA显示，在同居后28天，各段的微生物群落不能通过原始分组进行区分。

因此，无论原来小鼠分组如何，寄居小鼠的肠道微生物群都可以视为一个集合。

寄居小鼠的微生物群落与HMA小鼠的微生物群落紧密地聚集在一起，并且在每个段上都与HOMA小鼠的微生物群落不同，这表明口腔微生物群无法挑战肠道微生物群的优势地位。

有趣的是，对没有HOMA小鼠的进一步分析表明，在每一个片段中，同居小鼠的微生物群落也可以从HMA小鼠中分离出来。

这些结果表明，虽然口腔微生物群几乎受到肠道微生物群屏障的保护，但它重塑了本地肠道微生物群。

为了进一步了解口腔微生物群对肠道微生物群组成的影响，我们采用了LEFSE分析。

在胃中，从HMA小鼠到同居小鼠，七个属分类群显著增加。七个属级分类群中的一个是链球菌，它是HOMA鼠口中的优势属（相对丰度>1%）。

在小肠中，从HMA小鼠到同居小鼠的7个属级分类群显著增加，其中6个属级分类群是HOMA小鼠口部的优势属：肠球菌、链球菌、恩贝杆菌、卟啉单胞菌、莫拉西拉和滴虫。

在远端肠道，从HMA小鼠到同居小鼠的四个属级分类群显著增加。但没有一个是口中的优势属。

利用微生物源追踪器分析了同住对笼中同伴间微生物流动的影响，从而确定了集合过程是否参与了群落的形成。结果显示，口腔细菌对小肠有明显的生态入侵。

卟啉单胞菌与小肠微生物群定殖竞争。

为了进一步研究口腔细菌在小肠微生物群落中的功能位置，我们采用了前50个丰富的属级分类群的共生网络。

发现卟啉单胞菌与尿杆菌呈负相关（图5）。

图5

在口腔微生物群入侵之前，尿杆菌是小肠中最具优势的属，相对丰度最高（平均40.40%）。

口腔菌群入侵后，卟啉单胞菌的相对丰度显著增加，尿杆菌的丰度平均下降到8.79%。

此外，还发现卟啉单胞菌与HOMA小鼠口部的这些属（包括链球菌、肠球菌、不动杆菌、莫拉菌、毛球菌、梭杆菌、黄杆菌和乳酸杆菌）呈正相关（图5）。

这些结果表明，卟啉单胞菌作为一种常见的口腔细菌，在小肠与本地主要属的竞争中起着关键作用。