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小儿肠道微生物构成的成熟与哮喘的关系

Waleed Abu Al-Soud,Søren J. Sørensen&Hans Bisgaard

2018-01-11

人类肠道微生物群的组成在生命的最初几年内成熟。据推测，这一时期的微生物成分会导致免疫失调，并可能导致哮喘。丹麦科学家Hans Bisgaard团队通过将690名受试者生命第一年的16S rRNA基因扩增子测序的肠道微生物组成与随后的哮喘风险相关联，表明微生物组成不成熟的1岁儿童在5岁时患哮喘的风险增加。这种联系只在哮喘母亲所生的孩子中才明显，这表明在生命的第一年缺乏微生物刺激会引发他们的遗传性哮喘风险。相反，在这个时期肠道微生物群的充分成熟可能会保护这些儿童。

实验设计

1、样品采集、DNA提取和测序

分别在婴儿出生后的第1周、第1个月及第1年时采集其粪便样品，提取粪便基因组DNA序列。使用V4区引物505F和806R对16S rRNA基因进行扩增。将PCR产物（浓度≥6 ng/μL）稀释为3-6 ng/μL，加上测序引物和接头，使用Illuimina MiSeq系统，MiSeq Reagent Kits v2试剂盒，进行 2 × 250 bp双端测序。

2、数据处理及统计分析

对测序序列进行质控和组装。使用R语言对数据进行分析，对微生物α-多样性和β-多样性、各层级微生物的种类和丰度进行计算和统计。将16S测序数据上传Sequence Read Archive数据库，收录号号为PRJNA417357。

实验结果

1. 1岁期间儿童肠道微生物群的结构变化

在出生第1年，儿童肠道微生物组成的差异非常大，这些差异包括微生物多样性、复杂性及优势菌种的变化。研究人员收集690名儿童的1696份粪便样品，并对样品进行16S测序。这些样品中共聚类到3651个OTUs，平均每个样品中有116个，其中的优势菌为拟杆菌属、双歧杆菌属和韦荣球菌属。在1周和1月龄婴儿粪便中，微生物α-多样性无显著变化，到1岁时显著增加（图 1a）。婴儿在1月和1岁龄时的微生物β-多样性及丰度在前20的物种变化最大。

图1.

2. 微生物种群类型及其成熟情况由年龄决定

使用聚类分析法（Partitioning around medoids, PAM）区分粪便样品类型，以研究微生物群落组成差异。该法将样品分为2种可以表现出取样时儿童年龄大小的微生物群落类型（图 1b）。PAM簇1主要由1周和1月龄婴儿粪便样品组成（N=1019），PAM簇2则主要由1岁龄儿童的粪便样品组成（N=677）（图 1c）。PAM簇1的代表菌种分别是肠杆菌属、葡萄球菌和链球菌等，PAM簇2的是粪杆菌属、拟杆菌等。PAM簇2的 α-多样性比PAM簇1的高。β-多样性分析显示1月龄婴儿的微生物种群多样性与1岁龄儿童的PAM聚类无关。

在一系列环境因子中，与PAM簇显著相关的只有家庭中是否存在大的孩子。PAM簇1中，孩子家庭中有大孩子的只占24%（N=8），而PAM簇2中，孩子家庭中有大孩子的比例达到57%（N=334）。

图2.

3. 微生物类群结构与随后的哮喘相关联

研究人员分析了微生物群落构成和后来哮喘的发展之间的关联性。很多儿童在1岁时会周期性出现类似哮喘的症状，但这种症状在学龄前会随着年纪的增加而痊愈。648名儿童中，到5岁时仍患哮喘的比例占9%（N=60）。所有时期的患病风险和α-多样性都不存在显著关联。1岁龄患者和健康儿童的微生物群落β-多样性有显著差异。有微生物-哮喘关联性的147名儿童的母亲均为哮喘患者，而健康母亲生育孩子则无这种关联（图 2）。父母的哮喘状态与儿童微生物的α-、β-多样性无关。

图3.

4. 1岁龄儿童肠道微生物丰度与后来的哮喘相关

研究人员对1岁龄儿童粪便样品中最常见的20种微生物进行丰度检测，以验证后来患哮喘是否与早期特殊的细菌种类有关。结果表明，与健康儿童相比，5岁时有高风险患哮喘儿童的韦荣球菌属的丰度较高，罗斯氏菌等的丰度较低。若母亲患病，则其小孩哮喘的发展与8种细菌有显著关联（图 3），负相关的有粪杆菌属、双歧杆菌属等，正相关的仅有韦荣球菌属（图 3）。如果儿童患了哮喘，将其在1岁时丰度低的细菌当作是健康成型肠道微生物群落结构的决定成分。1周龄和1月龄婴儿粪便中丰度前20的细菌物种与哮喘的形成无关。由此可见，1岁龄和5岁龄儿童的微生物构成与哮喘的形成之间有很强的可预见性。

图4.

5. 1岁龄儿童肠道微生物群落类型和成熟程度低与后来患哮喘相关

研究人员用微生物PAM簇来指示群落的成熟情况，以验证微生物是否决定着哮喘形成。将儿童1岁龄时微生物是PAM簇1的与已转变成PAM簇2的作比较（图 4）时发现，如果1岁龄时微生物群落类型是PAM簇1，儿童患上永久性哮喘的风险增加了2.87倍，而PAM簇与暂时性哮喘无关联。同时，研究人员还使用另外一种方法，微生物-年龄z值(microbiota-by-age z-scores, MAZ)来指示群落的成熟情况。同样，低MAZ值的儿童患上永久性哮喘的风险也有所增加。

肠道微生物群落类型是PAM簇1或者MAZ值低的1岁龄儿童患上类似哮喘疾病的次数将比PAM簇2的或MAZ值高的儿童多，患病风险比例分别为1.54和1.26。

为探讨这些结果是否具有特定的哮喘表型特征，研究人员将儿童的过敏反应细分。不管儿童是否患有哮喘，或者有没有过敏反应，他们在1岁龄时的微生物β-多样性皆存在显著差异。致敏哮喘的表型与β-多样性的倾移有关。

研究总结

1. 对母亲是哮喘患者的儿童来说，他们1岁龄时的肠道微生物和后来患上哮喘之间有很强关联性。

2. 家里有兄弟姐妹的儿童能够完善自身的肠道微生物。

3. 有高风险患哮喘的婴儿出生后，建议用特殊的益生菌补充剂进行疾病预防。

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参考文献

Maturation of the gut microbiome and risk of asthma in childhood

Jakob Stokholm,Martin J. Blaser,Jonathan Thorsen,Morten A. Rasmussen,Johannes Waage,Rebecca K. Vinding,Ann-Marie M. Schoos,Asja Kunøe,Nadia R. Fink,Bo L. Chawes,Klaus Bønnelykke,Asker D. Brejnrod,Martin S. Mortensen,Waleed Abu Al-Soud,Søren J. Sørensen&Hans Bisgaard