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LAMP引物设计原则和LAMP引物设计的要点

LAMP技术

2022-11-09

环介导等温扩增技术LAMP, 英文是Lloop-mediated isothermal amplification，是一种核酸扩增技术，被广泛地应用于病原微生物检测和传染性疾病诊断等领域，具有快速、准确的特点。

LAMP扩增反应使用4-6个引物来识别目标DNA中的几个特定的区域。LAMP扩增技术的原理是：DNA在65℃左右可以处于动态平衡状态，在此温度下，利用4条特异性引物，依靠一种链置换DNA聚合酶，使链置换DNA的合成不停地自我循环复制，实现大量扩增。

LAMP扩增引物的种类

LAMP扩增技术使用的引物主要有一下几种：

FIP引物：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的F1区域序列相同。

F3引物：上游外部引物，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。

BIP引物：下游内部引物，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.

B3引物：下游外部引物，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。

Loop F/B：环状引物，可选，可提高反应速度（在10-15mins内完成检测），并提高检出效率（高出7个数量级），灵敏度要求不高的反应可以不用Loop F/B。

LAMP引物设计软件

一般LAMP引物是使用设计LAMP引物的专用软件，例如PrimerExplore等，在设计中应特别注意Tm 值、GC含量、碱基组成和二级结构等问题。

图1. LAMP引物的结构和分布

LAMP引物设计原则

LAMP引物设计的要点:

1. 引物的Tm值

在富含 GC 和正常的情况下约为 60-65°C，对于富含 AT 的约为 55-60°C，具体来说各引物如下：

F1c/B1c=64~65℃

F2/B2=59~61℃

F3/B3=59~61℃

LoopF/LoopB=64~65℃

2. 引物的GC含量

GC丰富和正常的情况下，GC含量约为 50-60%；AT丰富的情况下，GC含量约为 40-50%。

3. 引物区域之间的距离

F2的5'端与B2的5'端距离为120-160bp

F2的5’末端到F1c的5’末端约为40~60bp

F3的3’末端到F2的5’末端约为0~60bp

LoopF 位于F2c的3’末端和F1c的5’末端之间

LoopB 位于B1的3’末端和B2的5’末端之间

4. 避免二级结构

引物的设计应使其不易形成二级结构。3' 端序列不应富含 AT 或与其他引物互补。

5. 引物末端的稳定性

从以下末端区域计算 6bp 的 dG 应小于 -4kcal/mol，F1c/B1c 的 5' 末端和 F2/B2 的 3' 末端以及 F3/B3。

6.其他

如果目标序列上存在限制性酶切位点，除引物区域外，可用于确认扩增产物。

LAMP扩增反应最常见问题及解决办法

LAMP反应相对于qPCR来说更容易出现假阳性。其中，引物二聚体是产生假阳性的主要原因之一。

另外一个导致LAMP反应假阳性的原因是气溶胶污染，通过更换新的试剂、彻底清洁仪器和设备有助于避免污染。

在排除了气溶胶污染因素之外，如果通过优化Mg离子浓度依然对解决假阳性没有帮助的话，这种情况下通常建议需要重新设计引物。

引物的设计对LAMP扩增反应质量影响很大。要熟悉LAMP引物设计的原值，熟记LAMP引物设计的要点。建议在不同的反应温度下多测试几套引物，选择结果最好的一套作为最优引物。