CRISPR CAS蛋白的gRNA序列的设计流程
CRISPR gRNA设计
CRISPR Cas蛋白系统是细菌和古细菌在长期进化形成的一种免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒或者外源DNA。
目前，发现的CRISPR CAS系统根据不同的识别和切割的分子机制被分为了3大类，主要包括单一Cas蛋白、多cas蛋白相互作用、靶向DNA或者RNA等。
第1类CRISPR系统需要单一Cas蛋白，包括第II、V、VI型Cas蛋白。而第2类利用多种Cas蛋白，包括第I、III、IV型Cas蛋白。
这些CRISPR Cas蛋白利用RNA引导, 靶向、切断、并降解外来入侵的DNA。哺乳动物细胞中常用的用于基因编辑的Cas蛋白酶包括II型化脓性链球菌SpCas9、较小的金黄色葡萄球菌SaCas9，还有V型Cas12a蛋白（又称Cpf1）。在II型CRISPR系统中，crRNA与反式激活tracrRNA形成复合物(称向导RNA，gRNA)，靶向Cas9蛋白从而切断DNA中的特定位点。
CRISPR基因编辑应用中，gRNA中包含了一个与基因组DNA靶点互补的20 bp序列，靶点附近有一个前间区序列邻近基序，简称PAM,它将Cas9蛋白定位到该位点，从而在DNA中产生双链断裂DSB。CRISPR Cas9蛋白切割后产生的DSB主要通过两种机制进行修复：一种是细胞内源性的非同源端连接修复机制NHEJ，可以导致小的插入或删除(indels)，另一种通过同源定向修复HDR，添加外源性模板，产生新的DNA。
有同学经常问美格君:
如何设计有效的gRNA序列？
gRNA设计流程是怎样的？
美格君就利用CRISPR/Cas9基因编辑人源细胞的P53基因来展示如何设计gRNA序列。
现在网上有一些设计gRNA的软件。这里我们利用张峰实验网站上的软件来设计P53的sgRNA序列。
gRNA设计流程：
1. 先在NCBI网站上查询并下载TP53基因组序列。
登录NCBI网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
2. 查询限定物种的目标基因
3. 搜索目标基因基本信息
4. 下载P53基因基因组序列，复制目标编辑位点序列信息。
5. 登录张锋实验室的gRNA设计网站。最新网站地址：http://crispor.gi.ucsc.edu/
出现如下界面
6. 按照提示的步骤进行下一步操作。
7. 根据之前从NCBI下载的P53基因组序列信息，复制需要进行RNA编辑的目标区域序列，并粘贴到Step1中，在step2中选择物种信息，在step3中选择实验室常用到cas9蛋白和PAM序列NGG要的选项，然后点击SUBMIT提交。
8. 根据网站设计不同的gRNA，选取合适和评分最高的gRNA即可出。
9. 最后在设计好的gRNA序列的5'端点引入酶切位点，合成单链的正反向序列，酶切链接到建好表达载体上, 载体有相同酶切位点。
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