COVID-19病毒Mpro的结构及其抑制药物的开发
截止4月10日，新冠状病毒COVID-19已经造成全球超过160万人感染，10万人死亡。
目前没有针对性的治疗方法。为了快速发现临床使用的化合物，中国科学家启动了一项结构辅助药物设计--虚拟药物筛选和高通量筛选相结合的计划，让药物靶向COVID-19病毒主要蛋白酶Mpro。
Mpro是一种关键的CoV酶，在介导病毒复制和转录中起着关键作用，可以成为有吸引力的药物靶标。
研究人员通过计算机辅助药物设计确定了基于某种机制的抑制剂N3，确定了与该化合物复合的COVID-19病毒Mpro的晶体结构。接下来，通过基于结构的虚拟和高通量筛选的组合，测定了超过10000种化合物，包括批准的药物、临床试验中的候选药物和其他药理活性化合物，作为Mpro的抑制剂。
其中6种抑制Mpro，IC50值范围为0.67至21.4μM。Ebselen在基于细胞的测定中也显示出理想的抗病毒活性。研究结果证明了这种筛选策略的有效性，这可以快速发现具有临床潜力的药物导致，以应对没有特定药物或疫苗的新传染病。
COVID-19病毒基因组由约30000个核苷酸组成；其复制酶基因编码病毒复制和转录所需的两种重叠多蛋白：pp1a和pp1ab。主要蛋白酶Mpro，在这两种酶多肽上的11个点位进行切割，功能性多肽经过大量的蛋白水解加工，从多肽蛋白释放，这些被剪的片段组成了病毒复制机器，大量复制病毒。
根据Mpro在病毒生命周期中的重要性，以及缺乏密切相关的同源物，可以将Mpro作为抗病毒药物设计的靶标。
为了促进具有临床潜力的抗病毒化合物的快速发现，研究人员开发了一种结合结构辅助药物设计，虚拟药物筛选和高通量筛选的策略，以重新利用现有药物来靶向COVID-19病毒Mpro
建立高通量活性测定
具有天然N和C末端的重组COVID-19病毒Mpro在大肠杆菌中表达并随后纯化。为了表征其酶活性并进行抑制剂的高通量筛选，研究人员开发了荧光共振能量转移（FRET）测定法。
N3是COVID-19病毒Mpro的一种有效的不可逆抑制剂
在之前的一项研究中，科研人员使用计算机辅助药物设计CADD设计了Michael 受体抑制剂N3，它可以特异性抑制多种CoV Mpros，包括来自SARS-CoV和MERS-CoV12-15的那些。
它还在动物模型中显示出针对传染性支气管炎病毒的有效抗病毒活性。N3的CC50>133μM。
接下来，研究人员构建了COVID-19病毒Mpro的同源性模型，并使用分子对接，来查看N3是否可以靶向这种新的CoV Mpro。
对接姿势显示，它在基材结合袋内部正适合。
为了评估N3对COVID-19病毒Mpro的功效，研究人员进行动力学分析。
进展曲线显示它是该酶的依时、不可逆抑制剂。此外，该曲线的形状支持两步不可逆失活的机制。
该抑制剂首先以解离常数Ki，与COVID-19病毒Mpro（EI）结合；然后，在N3和Mpro（E-1）之间形成稳定的共价键。
这种评估需要平衡结合常数Ki（指定为k2/k1）和共价键形成的失活速率常数k3。
N3表现出对COVID-19病毒Mpro的非常有效的抑制，使得Ki和k3的测量证明是不可行的（扩展数据图1d，e）。
当发生非常快速的失活时，利用kobs/[I]来评估抑制作为伪二阶速率常数（k3/Ki）的近似值。结果表明该迈克尔受体具有有效的抑制作用。
COVID-19病毒Mpro与N3复合物的晶体结构
为了阐明该化合物的抑制机制，研究人员以2.1-Å分辨率确定了N3与Mpro复合物的晶体结构。
晶体结构的叠加表明，靶向该位点的抗病毒抑制剂应具有广谱抗CoV活性。
虚拟筛选
与N3复合的COVID-19病毒Mpro的结构提供了用于通过生物信息学筛选鉴定靶向COVID-19病毒Mpro的先导抑制剂的模型。
为了实现这一目标，使用Glide（v8.2）对接潜在结合化合物的内部数据库。结果表明，西那色林cinanserin具有抗病毒药物优化的潜力。
高通量筛选
接下来，研究人员用FRET分析来筛选由批准的药物、临床试验候选药物和天然产物组成的约10000种化合物的文库。主要命中包括七种化合物，它们是FDA批准的药物或临床试验/临床前候选药物。
然后确定它们的IC50值，其范围为0.67至21.4μM。
其中，双硫仑和卡莫氟是FDA批准的药物，而依布硒啉，紫草素，tideglusib，PX-12和TDZD-8目前正在进行临床试验或临床前研究。
依布硒啉对Mpro活性的抑制作用最强，IC50为0.67μM。
接下来，着手通过串联MS/MS分析鉴定这些化合物中潜在的共价抑制剂。
由于结构数据基于N3，科研人员研究了分子对接是否可以预测双硫仑，tideglusib和紫草素如何与这种蛋白质结合。
所有的分析都发现了合理的对接姿势，表明在基板结合袋内，它们可以适当的对接。
抗病毒活性测定
为了进一步证实体外酶抑制结果，研究评估了这些化合物是否可以在基于细胞的测定中阻止病毒复制。如图a所示，定量实时RT-PCR（qRT-PCR）证明依布硒啉和N3在COVID-19病毒感染的Vero细胞中以10μM处理的浓度显示出最强的抗病毒作用。
为了进一步证实体外酶抑制结果，我们评估了这些化合物是否可以在基于细胞的测定中阻止病毒复制。如图4a所示，定量实时RT-PCR（qRT-PCR）证明依布硒啉和N3在COVID-19病毒感染的Vero细胞中以10μM处理的浓度显示出最强的抗病毒作用。
依布硒啉和N3显示出对COVID-19病毒的抑制，个体EC50值分别为4.67μM和16.77μM。剂量-反应曲线表明它们都能够穿透细胞膜进入它们的靶标。依布硒啉是一种具有抗炎，抗氧化和细胞保护特性的有机硒化合物。
这些数据强烈表明依布硒啉治疗CoV的临床潜力。
晶体结构和对接数据表明，开发针对Mpro的单一抗病毒药物，或与其他潜在疗法组合，可以有效的针对所有CoV相关疾病。
参考文献
Structure of Mpro from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors
Zhenming Jin, Xiaoyu Du, Yechun Xu, Yongqiang Deng, Meiqin Liu, Yao Zhao, Bing Zhang, Xiaofeng Li, Leike Zhang, Chao Peng, Yinkai Duan, Jing Yu, Lin Wang, Kailin Yang, Fengjiang Liu, Rendi Jiang, Xinglou Yang, Tian You, Xiaoce Liu, Xiuna Yang, Fang Bai, Hong Liu, Xiang Liu, Luke W. Guddat, Wenqing Xu, Gengfu Xiao, Chengfeng Qin, Zhengli Shi, Hualiang Jiang, Zihe Rao & Haitao Yang
相关阅读