CAR-T分泌BiTE，可避开抗原逃逸，且无明显毒性。
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概述
CAR-T细胞治疗实体肿瘤作用是有限的，因为对于异质的靶抗原表达和肿瘤的生长，缺乏针对单一抗原的CAR-T细胞靶向抗原。
我们开发了一个双顺反子结构来驱动特定于EGFRvIII的CAR表达，一种胶质母细胞瘤特异性肿瘤抗原和一种针对EGFR的双特异性T细胞接合器BiTE， 这种抗原在胶质母细胞瘤中经常过表达，但也在正常组织中表达。
CART.BiTE细胞分泌EGFR特性的BiTE，这些BiTE可重新引导CAR-T细胞，并招集未转化的旁观者T细胞对抗野生型EGFR。
EGFRvIII特异性CAR-T细胞不能完全治疗具有异源性EGFRvIII表达的肿瘤，导致EGFRvIII阴性、EGFR阳性胶质母细胞瘤的生长。
然而，在成胶质细胞瘤的小鼠模型中，CART.BiTE细胞消除了异质性肿瘤。
BiTE-EGFR在局部有效，在颅内输送CART.BiTE细胞后，没有系统地检测到BiTE-EGFR。与特定于EGFR的CAR-T 细胞不同，CART.BiTE细胞在体内对人体皮肤移植无毒性。
胶质母细胞瘤GBM是最常见的脑恶性肿瘤，也是最致命的。目前治疗GBM的方法包括手术切除，放射治疗和替莫唑胺化疗，只提供增量效果，但受到全身毒性和大脑损伤的制约。
2017年，针对某些B细胞恶性肿瘤，美国FDA批准了靶向CD19的Car-T细胞治疗，从此彻底改变了血液癌症治疗方法。
最近，CAR方法被用于研究治疗GBM，并有一定的效果，但不可持续，很大程度上是由于肿瘤抗原表达的异质性，并在用针对单个靶点的CAR-T细胞治疗后逃逸。
我们之前开发了针对表皮生长因子受体EGFRvIII细胞外区域致癌突变的CAR-T细胞。
EGFRvIII仅在肿瘤中表达，而不存在于所有正常组织中。在一次人类试验中，我们证实，单次外周输注EGFRvIII CAR-T细胞（CART-EGFRvIII）可降低患者的EGFRvIII表达胶质瘤细胞。
对输注后手术切除的分析表明，EGFRvIII成功浸润了脑肿瘤，但存活的肿瘤普遍存在并保持野生型EGFR的高水平表达。
为了解决抗原异质性和增强GBM中的局部抗肿瘤活性，我们对CART-EGFRvIII进行基因编辑修饰，输送被称为BiTE的抗野生型EGFR双特异性抗体，这种抗体在正常大脑中没有检测到，但在超过80%的GBM中被扩增。
我们证明了由CAR-T细胞产生的EGFR靶向的BiTE能够调节针对异源性肿瘤的有效和特异性抗肿瘤活性，从而减轻EGFRvIII抗原丢失的影响。
局部BiTE分泌能够靶向抗原（例如，EGFR），否则，由于靶向毒性的原因，将无法用BiTE或CAR“药物化”处理。
实验结果
CART.BiTE对异质EGFRvIII的肿瘤有效。大约30%的GBM表达EGFRvIII，而80%或更多的GBM表达EGFR。
当GBM中的EGFRvIII突变消失时，野生型EGFR的扩增得以维持。尽管在皮肤、肺和肠道等正常组织中发现了EGFR的表达，但在我们分析的来自健康人体中枢神经系统组织的80个核心样本中，没有检测到它的存在，与先前的报告一致。
为了重述异种移植模型中复发时抗原逃逸的情况，我们在NSG小鼠的侧翼植入了具有异质EGFRvIII表达的肿瘤。
静脉注射未转导（UTD）T细胞的小鼠显示出EGFRVIII阳性肿瘤的生长，用CARTEGFRvIII细胞治疗的小鼠显示肿瘤生长停止。
我们提出了CART.BiTE的概念（图1b），理论上它具有多抗原靶向的优势，也具有招募和激活旁观T细胞的能力。
图1
我们设计了一个实验，用来评估CART.BiTE对免疫受损小鼠原位肿瘤的活性。首先，我们发现在治疗脑肿瘤时，心室内输注 CAR-T细胞是可行、安全和优于全身输注的。
设计和生成CART.BiTE。
我们生产了两个CART.BiTE结构，都是基于第二代CARTEGFRvIII骨架，包含4-1BB和CD3ζ 细胞内信号域（图2a）。
图2
这些BiTE是针对野生型EGFR或CD19设计的，后者既作为阴性对照，又作为概念验证，用于将我们的发现推广到抗原中。
BiTE互补DNA构建（图2c，d）。
UTD T细胞不能产生可检测到的分泌性HIS标记蛋白，但在CART.BiTE细胞的上清液中测量了可溶性BiTE。BiTE细胞和总BiTE浓度随着时间的推移，以大约10 pg d-1的速率增加，对T-细胞膨胀进行了校正（图2h）。
由 CAR-T细胞分泌的BiTE招募旁观效应器活动。
目前还不清楚分泌性BiTE是否只招募转导细胞，而不是定向非转导旁观T细胞。
为了表征分泌性BiTE与旁观T细胞之间的相互作用，我们用共聚焦显微镜观察了在培养过程中Car-T细胞和未转导的T细胞上EGFR异性BiTE的分布。
通过mCherry荧光蛋白的表达来鉴定转导细胞。生物素化可溶性EGFR检测到抗EGFR scFv，它可以以CAR的形式表达为一种跨膜蛋白，或者表达为与CD3结合位点相反的BiTE的未结合臂。
在用CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR转导的培养物中，我们发现了EGFR特异性BiTE的证据，这些BiTE不仅与转导的mCherry阳性细胞结合在一起，而且还与旁观者、mCherry阴性、未转导的细胞表面结合在一起。
我们评估了分泌性BiTE针对肿瘤细胞的增强旁分泌免疫反应的能力，特别是旁观细胞。
GBM与原代人T细胞共培养后，我们发现只有CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR介导了mCherry阴性细胞中CD25和CD69的早期诱导。
在含有CART-EGFR细胞的共培养中也观察到活化，但这仅限于 mCherry阳性人群，而这些培养中的旁观细胞保持不变。
旁观T细胞被未转导的Jurkat报告T细胞所取代，该实验证明只有在分泌BiTE-EGFR的人CAR-T细胞存在的情况下，抗原特异性激活。
CART-EGFR细胞在培养过程中, 遇到目标抗原后，就会随意地增殖。
在含有阴性对照的CAR-T细胞的孔中未检测到这种情况，这些细胞靶向EGFRvIII、或分泌CD19特异性BiTE。
而在用CART-EGFRvIII转导的培养基中则相反。
在旁观T细胞内观察到BiTE-EGFR增殖。
最后，我们采用了一个0.4μm的Transwell系统，该系统在基因修饰细胞和UTD效应器之间提供了物理屏障，同时允许可溶性BiTE在细胞腔之间自由通过（图3i）。
数据是通过一个基于阻抗的平台获得的，该平台集成了微电子技术，以获取实时细胞活力随时间变化的数值和动力学数据。
我们发现，CART.BiTE细胞产生的BiTE成功地通过Transwell 孔膜转移，在有GBM存在的情况下，调解由未经修饰的T细胞产生的Th1细胞因子和抗原特异性细胞毒性（图3j，k）。
图3
值得注意的是，当UTD效应细胞被高度纯化的调节性T细胞（Tregs）取代时，也观察到抗肿瘤细胞毒性。
同时通过CAR和BiTE的重定向导致了有利的T细胞分化和表型。
为了了解通过CAR和BiTE同时激活的效果，我们分离了纯度大于97.5%的CAR-T细胞培养的转导的mCherry阳性亚群。
这一步使我们能够排除对CAR消极的旁观细胞的影响。利用这种方法，我们证明，通过BiTE调节的细胞毒性，CAR转导的T细胞保持了有效溶解肿瘤细胞的能力。
此外，与单独使用CAR相比，CAR-T细胞通过CAR和BiTE再导向，产生了类似的细胞毒性活性。
这些数据提供了证据，证明CAR和BiTE能够一起发出信号，而不一定产生冲突的、适得其反的效果。
为了进一步描述CAR转导细胞中的BiTE活性，我们还比较了每种刺激方式对其启动和维持T细胞增殖的能力。
值得注意的是，虽然BiTE仅限于通过CD3刺激激活T细胞，但CAR-T细胞被设计来表达细胞内CD3ζ和有效的共刺激域，如4-1BB。
在用辐照靶细胞连续刺激抗原后，经过BiTE刺激的分类转导细胞的生长在大约12天后趋于平稳。
然而，通过CAR反复刺激抗原，其增长率保持对数增长, 超过1个月。
当通过CAR和BiTE同时激活时，单独BiTE观察到的增殖缺陷几乎完全被消除。
临床研究表明，BiTE有选择性地促进高分化的效应记忆细胞（TEM）的扩展；
然而，使用低分化干细胞记忆（TSCM）或中央记忆（TCM）亚型细胞获得了更好的CART结果。
仅通过BiTE长期刺激的CAR-T细胞优先富集了TEM细胞，而那些仅仅利用的CAR或BiTE与CAR激活的细胞似乎在分化程度较低的 TCM区域富集。
我们发现，单独通过BiTE刺激可上调与T细胞衰竭相关的几种免疫检查点抑制剂的表达（例如，PD-1、TIM-3和LAG-3）；然而，当结合CAR和BiTE时，T细胞衰竭的极化作用被逆转。
这些发现证实了先前的研究，证明了共刺激，特别是通过4-1BB，对减轻CAR-T细胞的衰竭有良好的效果。
在体外，CART.BiTE对多种胶质瘤模型和人源肿瘤异体移植模型PDX有效。接下来，我们确定了CART.BiTE细胞对几种表达EGFR或EGFRvIII的胶质瘤模型的疗效。
首先，我们生产了用候选结构转导的Jurkat报告T细胞，并在体外对特征明确的EGFRvIII阴性、EGFR阳性的胶质瘤细胞株进行选择性激活评估。
我们没有在含有UTD细胞或分泌BiTE-CD19的CAR-T细胞的井孔中检测到T细胞活化。相比之下， CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR细胞表现出对GBM的选择性激活。
在使用原代人类T细胞进行的类似实验中，当与胶质瘤细胞在依赖于BiTE的环境中培养时，也发现CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR细胞产生Th1促炎细胞因子 IFN-γ和TNF-α，特定的EGFR样式。
使用标准的生物发光细胞毒性分析，我们证明CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR细胞具有高度的细胞毒性，对EGFR阳性胶质瘤具有特异性。
我们证实，BT74显示了EGFR和EGFRvIII的异质表达。Jurkat报告T细胞用CART-EGFRvIII转导，强调了这种异质性。
通过活体细胞、图像的分析，我们证实了CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR细胞对BT74的抗肿瘤活性。
CART.BiTE对小鼠EGFRVIII阴性肿瘤的治疗是有效和安全的。
接下来，我们确定CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR的体内疗效是否依赖于CAR对其同源抗原EGFRvIII的识别，或者分泌的BiTE是否足以在体内实现可测量的抗肿瘤反应。
为了验证这一假设，我们将人胶质瘤细胞U251原位植入NSG小鼠体内，然后进行CART.BiTE细胞的心室内注射。
利用这个模型，我们证明了注射CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR细胞后建立的胶质瘤的持久回归。
我们假设，鉴于BiTE分泌水平非常低，与其他方法相比，EGFR的局部靶向将提高安全性。
为了验证这一假设，我们使用了我们先前发表的皮肤移植物毒性模型，该模型能够在体内评估对内源性表达EGFR的人体组织的免疫反应。
为了便于观察和收集分析，我们选择了皮肤移植术。
将人的皮肤，通过表皮表达EGFR，移植到NSG小鼠的背侧，在用CAR-T细胞治疗前，先让其完全愈合。
我们通过免疫组织化法IHC确认了移植人皮肤上的EGFR表达。
CARTEGFR细胞作为阳性对照，而抗EGFRvIII的CAR-T细胞则被用作阴性对照。
所有T细胞均通过静脉注射而非颅内注射，以增加循环的CAR-T细胞和BiTE的敏感性毒性。用CART-EGFR治疗的小鼠在皮肤移植的真皮和表皮中表现出强烈的淋巴细胞浸润。
IHC的分析显示，显著的CD3+T细胞浸润，角蛋白形成细胞凋亡区域，TUNEL+细胞，与皮肤移植物抗宿主病相一致。
相反，在用CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR细胞治疗的小鼠中，这些体征消失。
通过免疫印记和ELISA测量，在用CART.BiTE细胞处理的小鼠外周血样本中未检测到BiTE。
与胶质瘤细胞相比，人角质形成细胞的表面EGFR表达降低，这表明在肿瘤中发现的EGFR表达增加可能是最佳CAR-T活性所必需的。
我们可以设计一个CAR，用来分泌低水平的BiTE ，靶向健康组织上的抗原。
参考文献
CAR-T cells secreting BiTEs circumvent antigen escape without detectable toxicity
Bryan D. Choi, Xiaoling Yu, Ana P. Castano, Amanda A. Bouffard, Andrea Schmidts, Rebecca C. Larson, Stefanie R. Bailey, Angela C. Boroughs, Matthew J. Frigault, Mark B. Leick, Irene Scarfò, Curtis L. Cetrulo, Shadmehr Demehri, Brian V. Nahed, Daniel P. Cahill, Hiroaki Wakimoto, William T. Curry, Bob S. Carter & Marcela V. Maus
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