用CRISPR Cas12a进行快速新冠病毒检测
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如何利用CRISPR Cas蛋白开发快速检测产品系列4
1. 选择恒温扩增体系。常用的有RDA、RPA、LAMP恒温扩增方法。
2. 选择合适的CRISPR Cas蛋白。
3. 确定目标基因序列。例如新冠病毒COVID19的O基因和N基因。
4. 配置反应体系。
5. 逐级稀释样本，测试灵敏度。
6. 优化反应体系，提高反应灵敏度。
CRISPR和Cas系统在序列特异性RNA分子的引导下识别和降解外源核酸。一些Cas酶如Cas12a酶、Cas12b酶、Cas13a酶、Cas13b酶和Cas14酶在结合特定靶点后显示出附带切割活性，可以用于检测核酸的诊断用途。在靶识别时，激活的Cas核酸酶无差别地切割附近的单链DNA（ssDNA）。通过引入荧光团和猝灭标记的ssDNAreporter报告分子或荧光团和生物素标记的ssDNA reporter报告分子，可以用荧光读取器或侧流试纸条检测。
虽然所有这些蛋白都是RNA引导的核酸酶，但Cas13a蛋白和Cas13b蛋白是RNA酶，而Cas12a蛋白、Cas12b蛋白和Cas14蛋白是DNA酶。因此，基于Cas13a和Cas13b的检测需要RNA聚合酶的转录步骤，相反，Cas12a蛋白、Cas12b蛋白和Cas14蛋白可以直接使用DNA作为底物。为了提高检测灵敏度，通常需要用等温法或PCR法对核酸进行预扩增。通过结合RDA, RPA重组酶聚合酶扩增技术，Cas12a和Cas13a可以在给定的反应中进行分子检测。
在这项研究中，我们提出了一种用CRISPR-Cas12a系统检测SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因的方法。通过RPA技术与Cas12a的检测相结合，使用荧光阅读器或通过肉眼在50分钟内获得检测结果（图1A）。
图1。基于Cas12a的SARS-CoV-2检测工作流程。
用提取的RNA或裂解的样本可作为RPA Cas12a检测的输入。
（a）使用荧光阅读器或其他可视检测方法，可以在50分钟内看到结果。
（b） RNA提取或快速样品裂解后进行分析所需的最少设备，包括紫外线成像仪、加热块（42°C和37°C）、移液管和吸头、Eppendorf管、试剂和侧流条、CRISPR相关cas蛋白、RPA重组酶聚合酶扩增；RT酶，室温；SARS-CoV-2严重急性呼吸综合征冠状病毒2型；UV紫外线。
由于寡核苷酸序列对于快速且敏感的RPA是至关重要的，因此需要筛选引物以建立优选的检测方法。我们分别测试了18个和15个ORF1ab和N的靶基因引物组合，每个反应使用100个拷贝的RNA。为了筛选出ORF1ab基因的最佳引物组，用一对反向引物（R2）对正向引物（F1～F5）进行筛选，选出最佳正向引物（F5），然后用它筛选所有的反向引物（R1～R5）。鉴定出性能最好的引物对，并在随后的实验中使用（F5+R1，图2A-2D）。对SARS-CoV-2的N基因引物采用相同的程序，F4+R2引物组表现出最好的性能（图2E-2H）。
图2。引物筛选。
用单个正向或反向引物与相应的反向或正向引物对ORF1ab（a–d）和N（e–h）引物进行筛选，选出性能最好的引物，然后用其进行第二轮筛选，以确定性能最好的引物对。
Cas12a反应在10min获得荧光信号。
为确定该系统的分析灵敏度，将靶点依次稀释至1、10和100拷贝/μL。然后从每个稀释产物中取1μL的RNA为模板，进行3个独立重复，每个重复做5个技术重复。
CRISPR cas12a对ORF1ab和N基因的分析都能够在所有分析稀释液中检测到相应的靶点，并且在非模板对照中没有显示任何信号。这些结果说明我们开发的CRISPR-Cas12a分析达到单拷贝敏感性。
然后，我们将引物与其他冠状病毒基因组进行调整比对，发现序列与大多数病毒序列不相似。
此外，靶向SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因的crRNAs与其他冠状病毒有一些不匹配，这表明该分析对靶点的高度特异性，因为crRNAs已被证明对单核苷酸突变敏感。
我们进一步实验评估了我们的检测方法对4株人冠状病毒和11种呼吸道病原体的特异性。SARS-CoV-2与受试呼吸道病原体之间未观察到交叉反应。这些结果共同证明所建立的系统对SARS-CoV-2具有高度的特异性。
我们测试了各种样本裂解方案，发现使用Triton X-100、Tween -20、盐酸胍，附带加热步骤的方案产生最强的信号。然当取消加热步骤时，信号显著降低，这意味着在没有加热的情况下样品不完全溶解。该方案使样品处理在5分钟内完成，未提取的裂解液可直接作为RT-RPA扩增的模板。
可视检测对于核酸诊断至关重要。
我们开发了一个在5′端标记FAM分子和在3′端标记生物素的报告分子。当与横向流动条结合时，肉眼可见报告分子的消灭。该方法显示模板的分析灵敏度为1拷贝/μL。
接下来，我们比较了RPA结合CRISPR-Cas12a的方法与仅RPA的方法的灵敏度，后者似乎不如前者敏感，在侧流分析中，ORF1ab和N基因的观察检测限（LoD）值分别为50拷贝/μL和10拷贝/μL。在荧光检测试验中，在给定的反应中，仅RPA检测的灵敏度也低于基于Cas12a的检测，ORF1ab和N基因的LoD分别为1000和100拷贝。这一观察结果可能归因于Cas12a的附带活性诱导的信号放大效应。因此，可以合理地推测，基于CRISPR-Cas12a酶的检测方法通常比仅使用RPA的系统更敏感。
参考文献
Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a
Dan Xiong ,Wenjun Dai ,Jiaojiao Gong ,Guande Li,Nansong Liu,Wei Wu,Jiaqiang Pan,Chen Chen,Yingzhen Jiao,Huina Deng,Junwei Ye,Xuanxuan Zhang,Huiling Huang,Qianyun Li,Liang Xue ,Xiuming Zhang ,Guanghui Tang
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