利用CRISPR–Cas12b进行高效的植物基因工程编辑
近年来，作为RNA引导的核酸内切酶，CRISPR-Cas9和Cas12a蛋白已成为植物基因工程中的主要序列特异性核酸酶 (SSN)。
CRISPR-Cas12b蛋白系统是一个新兴的基因工程系统。
我们比较了分别来自嗜酸脂环杆菌Alicyclobacillus acidoterrestris （Aac）、嗜酸脂环杆菌Alicyclobacillus acidiphilus （Aa）、嗜热淀粉芽孢杆菌Bacillus thermoamylovorans （Bth）和hisashii芽孢杆菌Bacillus hisashii （Bh）的Cas12b在水稻基因工程中的应用。
我们发现AaCas12b比AacCas12b蛋白和BthCas12b蛋白具有更高的靶向突变效率，这在多重基因组编辑中得到了进一步的证实。我们还设计了Cas12b系统进行靶向转录抑制和激活。
我们建立的Cas12b系统是继Cas9蛋白和Cas12a蛋白之后第三个有前景的植物基因CRISPR系统。
Cas12b蛋白，一种Class 2, V-B型CRISPR系统，是一个用于哺乳动物基因组编辑的新SSN。
与Cas12a（Cpf1，class 2 V-A系统）相似，Cas12b蛋白偏好富含T-rich 的PAM，并生成DNA双链裂解的交错末端。
与Cas9蛋白相似，Cas12b蛋白需要CRISPR RNA（crRNA）和反式激活的crRNA，可以组合为sgRNA，用于DNA靶向。
而Cas12a蛋白只需要crRNA。因此，Cas12b蛋白比Cas12a蛋白更适合于多功能RNA工程。
此外，Cas12b蛋白质大小上比Cas9蛋白和Cas12a蛋白小。在人类和小鼠细胞中，AaCas12b酶几乎不能耐受原间隔区中的单个碱基对错配，这表明它具有很高的靶向特异性。
因此，将Cas12b蛋白系统用于植物基因工程是很有必要的。
我们对AacCas12b蛋白、AaCas12b蛋白和BthCas12b蛋白的植物基因编辑能力进行了测试。
由于AaCas12b蛋白与AacCas12b蛋白具有高度的序列同源性，AacCas12b蛋白酶和AaCas12b蛋白蛋白酶均使用AacCas12b sgRNA基因骨架。
类似地，我们将BthCas12b-sgRNA基因骨架应用于BthCas12b蛋白，这些Cas12b-DNA编码序列针对水稻进行了密码子优化。
我们采用了双聚合酶II（Pol II）启动子表达系统和hammerhead virus–hepatitis delta virus 病毒双核酶引导RNA处理系统，为CRISPR–Cas12a蛋白建立系统（图1a）。
图1a
我们分别用GTTG和ATTC PAM靶向OsEPFL9和OsGS3中的两个位点。为了量化Cas12b核酸酶的编辑效率，将表达载体转染进水稻原生质体。
aacas12b酶在两个站点的编辑效率都超过10%，高于AacCas12b蛋白（~5%）（图1b）。bthcas12b酶显示出非常低的编辑效率（图1b）。
图1b
AaCas12b、AacCas12b和BthCas12b主要造成了4-14个碱基对（bp）缺失，多于Cas9（1-3 bp）诱导的缺失。
在另外两个GTTG-PAM位点中，AaCas12b蛋白和AacCas12b蛋白在一个位点（GTTG-01）产生高编辑效率（50%-60%），但在另一个位点（GTTG-02）失败。
进一步的测试表明AaCas12b可以编辑CTTG和GTTC-PAM位点。然而，这两种Cas12b蛋白变体在另外三个CTTG和两个GTTC-PAM位点以及三个CTTC和两个GTTA-PAM位点上基本失效。
实验数据表明，AaCas12b蛋白和AacCas12b蛋白是水稻靶向诱变的有效SSN，它们通常识别VTTV-PAMs，更倾向于ATTV和GTTG-PAMs。
对3个Cas12b蛋白同源序列的初步比较表明，AaCas12b蛋白在水稻靶向诱变方面优于AacCas12b和BthCas12b。
我们通过使用携带双错配核苷酸的OsEPFL9-sgRNA02的6个crRNA原间隔区序列（位置位于1-2、5-6、9-10、13-14、17-18和19-20）来评估AaCas12b蛋白的靶向特异性。
将这6个构建体与水稻原生质体中的目标对照构建体进行了比较。
突变频率数据表明，所有这些错配的核苷酸都完全消除了靶位点的编辑活性。用Os12g24050-sgRNA01靶向一个独立位点也获得了类似的结果，表明AaCas12b是水稻细胞中一个高度特异的SSN。
我们进一步缩短了OsEPFL9-sgrnan02的原间隔区的长度，发现原间隔区为18个核苷酸或更短的时候，AaCas12b完全丧失了编辑活性。
这一结果与Cas9和Cas12a形成了鲜明的对比，Cas9蛋白和Cas12a蛋白通常在17-18核苷酸原间隔区仍具有核酸酶活性。
总之，我们的数据表明AaCas12b蛋白是用于植物基因编辑的高度特异的SSN。
接下来，我们用Cas12b产生水稻突变体。
以OsEPFL9sgRNA02为靶点的AaCas12b蛋白和AacCas12b蛋白构建体转化到水稻，用农杆菌愈合。
数据显示，AacCas12b的突变率为36.4%，AaCas12b的是54.2%。
我们构建了一个基于双Pol-II启动子和hammerhead–sgRNA–hepatitis delta virus array 病毒阵列的复合Cas12b蛋白系统（图2c）。
图2c
我们用三个sgRNAs同时靶向三个水稻基因：OsROC5-sgRNA02、OsEPFL9sgRNA02和OsGS3-sgRNA02。
以AacCas12b和AacCas12b为基础，我们构建了水稻稳定转化的两种复合结构。对于每个结构，我们分析了24条独立的T0线。
AaCas12b在OsEPFL9和OsGS3基因上都导致了非常高的突变率：在OsEPFL9-sgrnan02位点，16个（66.7%）T0系为突变体，7个系为双等位基因突变；在osgs3sgrnan02位点，17个（70.85%）T0系为突变体，11个系为双等位基因突变（图2e）。令人印象深刻的是，16个品系是双突变体，7个品系是双等位基因双突变体（图2e）。
图2e
我们通过产生具有高度特异性AaCas12b蛋白和AacCas12b蛋白的组合突变体，成功地证明了多重基因组编辑。
参考文献
CRISPR–Cas12b enables efficient plant genome engineering
Meiling Ming, Qiurong Ren, Changtian Pan, Yao He, Yingxiao Zhang, Shishi Liu, Zhaohui Zhong, Jiaheng Wang, Aimee A. Malzahn, Jun Wu, Xuelian Zheng, Yong Zhang & Yiping Qi
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