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如何利用CRISPR Cas蛋白开发快速检测产品系列3

由于SARS-CoV-2引起的COVID-19大流行影响人类生活的各个方面。

我们迫切需要高效、快速、准确的检测技术来控制新冠病毒的传播。基于RT-qPCR的方法是新冠病毒检测的金标准。

但是，这些方法需要训练有素的技术人员，复杂的基础设施和较长的时间，从而限制了它们的实用性。

逆转录环介导的等温扩增RT-LAMP是在单一温度下进行的一步核酸扩增方法，已用于比色病毒检测。

CRISPR-Cas12和crispr-Cas13系统也已被用于病毒病原体检测。

为了应对新冠病毒检测的挑战，Magdy教授团队建立了一个涉及RT-LAMP和CRISPR-Cas12的系统，用于快速、准确地检测SARS-CoV-2，并将其命名为系统iSCAN，in vitro Specific CRISPR-based Assay for Nucleic acids detection。

1. iSCAN技术的特点：

1） 快速，RT-LAMP和CRISPR-Cas12反应需要不到1小时；

2） 特异性，检测取决于Cas12酶对SARS-CoV-2基因组序列的识别和随后的切割；

3） 现场部署，只需要简单的设备；

4） 易于使用，侧流免疫层析技术使测定结果易于评估。

iSCAN方法可以大规模现场部署，适用于早期发现SARS-CoV-2携带者，使其能够有效分离和隔离，从而限制病毒的传播。

iSCAN方法的SARS-CoV-2检测试剂盒已经使用来自COVID-19阳性患者的临床样品中提取的RNA进行了验证，为病毒检测提供了广泛部署的可能性, 可以用于其他病原体的检测。

2. 实验结果

2.1. LAMP反应使用具有链置换活性的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶大片段，用于有效扩增目标DNA。

通过用合适的等温RT逆转录酶补充LAMP反应，逆转录LAMP（RT-LAMP）可用于通过逆转录目标RNA和随后的一步DNA扩增来检测RNA。

研究人员表达并纯化了来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的重组Bst DNA聚合酶大片段（称为Bst-LF），以及合成的，定向进化衍生的RT'异种聚合酶'，RTx酶。

测定纯化的蛋白质对具有纯化的Bst-LF的LAMP和具有RTx和Bst-LF的RT-LAMP的催化活性和性能，并使用针对SARS-CoV-2基因设计的、公开的RT-LAMP引物与商业Bst和RTx酶进行比较。

研究团队内部自产的蛋白质显示出与商业酶相当的有效且一致的LAMP和RT-LAMP扩增。

接着，研究人员构建并测试了几套针对SARS-CoV-2基因组的LAMP引物。

SARS-CoV-2基因组是由约30kb正单链RNA构成，具有5'-cap结构和3'poly的尾部，含有几种冠状病毒特征基因，例如S (spike), E (envelope), M (membrane), and N (nucleocapsid) 基因（图1A）。

图1

基因组的其他元素，如ORF1a和ORF1b，编码非结构蛋白，包括RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）。

研究靶向N和E基因中的两个区域。病毒基因组3'端的N基因在冠状病毒中高度保守。团队设计了LAMP引物以产生~200bp的扩增产物，确保足以进行基于LAMP的检测的稳健扩增。

研究人员对合成的SARS-CoV-2序列进行了RT-LAMP实验。鉴定了N和E基因的引物组，它们能够特异且有效地扩增合成的病毒片段，但不扩增对照。

2.2. 通过RT-LAMP与CRISPR-Cas12a蛋白结合，可以有效检测SARS-CoV-2

RT-LAMP的灵敏度与RT-PCR相当。

然而，由于引物二聚体形成，非特异性扩增和同时运行大量样品时的交叉污染，反应的特异性和结果的可视化可能是复杂的。因此，为了开发高灵敏度和特异性的检测系统，我们将CRISPR-Cas12蛋白与RT-LAMP靶标扩增相结合，建立了SARS-CoV-2检测的两管iSCAN系统。

为此，研究人员纯化了LbCas12a蛋白直系同源物，证实了纯化的Cas12a蛋白的催化顺式切割活性和附属切割活性。

用RT-LAMP进行病毒检测和扩增，并结合CRISPR-Cas12蛋白作为特异性因子。来自Cas12的阳性信号为病毒检测提供了特定且准确的信号。

在RT-LAMP扩增产物中Cas12a蛋白结合并切割靶病毒序列后，附属ssDNA-FQ报告基因被切割（图1B）。

团队设计了特异于SARS-CoV-2的N和E基因组区域的crRNA，用引物筛选测定中确定的引物组进行扩增。

将RT-LAMP产物引入Cas12a蛋白，Cas12a蛋白仅在存在特异性crRNA和RT-LAMP扩增子的情况下切割ssDNA报告基因，证实了系统的特异性和活性。

接下来，定量比较了iSCAN系统与标准的RT-qPCR检测的灵敏度，以确定检测限（LoD）。

稀释合成病毒RNA，每个反应的范围从0到20000拷贝。LoD测定显示，iSCAN测试每个反应可检测低至10个RNA拷贝，而RT-qPCR检测每个反应是5个拷贝。

2.3. 验证RT-LAMP+CRISPR-Cas12a蛋白用于检测临床样品中的SARS-CoV-2

为了验证我们的检测系统是否适用于患者的实际样本，研究人员测试了来自由RT-qPCR方法鉴定的5位COVID-19阳性患者和2位阴性人士的核算提取物。

阳性样本，用qPCR N基因引物的Ct值是15 ~ 40。

使用基于荧光的检测，每个样品至少重复三次，iSCAN针对SARS-CoV-2 E基因的检测显示与RT-qPCR结果100%一致。

接下来，研究人员测试了来自21个SARS-CoV-2阳性患者和3个阴性患者的另外24个鼻咽拭子样品中提取的总RNA，来评估iSCAN。

当使用E基因靶标时，iSCAN测定的灵敏度低，21个阳性样品中的8个测试为阳性，3个阴性样品中的3个测试为阴性。

然而，当使用N基因测定时，观察到测定的灵敏度显着增加，21个阳性样品中测试为阳性的18个（~86%），3个阴性样品被正确诊断，与qPCR数据一致（100%）。

2.4. 通过RT-LAMP配合CRISPR-Cas12b蛋白现场检测SARS-CoV-2

我们的两管iSCAN系统可以可靠和特异性检测新冠病毒。但是为了方便POCT现场检测，我们开发了1管的iSCAN系统。

为此，我们表达并纯化了来自大肠杆菌（BL21）DE3的AacCas12b（Alicyclobacillus acidoterrestris）和AapCas12b蛋白（Alicyclobacillus acidophilus）变体。

数据显示，两种Cas12b蛋白变体都能够在62℃下使用相同的sgRNA诱导双链断裂，并且在与ssDNA-FQ报告基因孵育时具有强大的附属活性。

利用嗜热Cas12b蛋白变体的目标是开发一种简单的一管单温检测方式，最大限度地减少液体处理。

这可以通过在一管中同时混合所有扩增和基于CRISPR的检测试剂来实现，这允许同时进行靶扩增和检测。

一管检测系统能够检测病毒RNA，与两管系统相比效率较低。

估计是同一管中同时存在活性Cas12b-sgRNA复合物导致初始RT-LAMP产物的消化，显着影响RT-LAMP扩增的性能，并因此影响RT-LAMP扩增检测的稳定健性。

为了提高一管检测的性能，研究人员将Cas12b酶与其余检测组分分离，让RT-LAMP反应在Cas12b酶与其他组分混合之前进行，

通过在管壁上的液滴中加入Cas12b蛋白。

经过观察发现，这种点滴式一管法提高了检测性能。AapCas12b蛋白始终可以达到每个反应10个拷贝的LoD。

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参考文献：