细胞与组织培养技术大全(二)培养细胞的生长特点与增殖过程
细胞培养是生物技术研究的基础，随着克隆技术和细胞治疗技术的推广和应用，对细胞培养提出了更高的要求。
如何培养好细胞？
这里，美格君从动物细胞培养开始，和大家一起聊一下动物细胞的培养。
动物细胞培养技术大全
第一节 动物细胞培养基础
第二节 动物细胞、 组织培养的方法
第三节 培养细胞的检测和特性鉴定
第四节 动物细胞体外培养举例
第五节 细胞同步化
第六节 器官培养
第一节 动物细胞培养基础
一、 动物细胞与组织培养的基本概念
二、 动物细胞体外培养特点
三、 动物细胞培养的发展历史
四、 动物细胞的体外培养一般条件
五、 动物细胞的体外培养生物学特性
五、 动物细胞的体外培养生物学特性
(二） 培养细胞的生长特点
1、细胞贴附和伸展
2、接触抑制
3、密度抑制
1． 细胞贴附和伸展
什么是细胞贴附/细胞贴壁？
细胞贴附，英文是cell adhesion，也称为细胞贴壁，是指贴壁依赖性细胞在培养表面上贴附和铺展的过程。
贴附并伸展， 是多数体外培养细胞的基本生长特点。
细胞贴壁底物：包括其他细胞、 胶原、 玻璃或塑料等。 一类特殊的促细胞附着的物质（如基膜素、 纤维连接素、 Ⅲ型胶原、 血清扩展因子等） 可能参加细胞的贴附过程。
培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样； 当与底物贴附后， 细胞将逐渐伸展而形成一定的形态。
✿ 细胞贴壁与什么因素有关？
细胞能否在培养表面上贴附，主要有下列因素：
①细胞本身的特性，即细胞因素；
②生物因素，如促附着因子；
③细胞与培养表面接触概率，
④细胞与培养表面的相容性，这又与表面的化学物理性质有关。
⑤细胞贴壁速率也与培养表面的化学物理性质有关，特别是培养表面上的电荀密度影响较大。血清中的冷析蛋白和纤维粘连蛋白可在培养表面与细胞间架桥，有利于加快细胞贴附速率。细胞在培养表面上的铺展除了与以上因素有关外，还与表面情况特别是光滑度有关。
⑥机械、 物理因素，例如低温或培养液的流动过快； 离子的作用等。
✿ 避免细胞贴壁可采取的措施：
① 包被；
② 减少接种时细胞悬液的量；
③ 培养液中离子成分及浓度
④ 培养液的温度
✿ 细胞贴附的一些基本概念
● 细胞粘附分子：是众多介导细胞间或细胞与细胞之间相互接触和结合分子的统称。
● 细胞外基质：是由动物细胞合并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。
二者大多数均为糖蛋白，因此具有较强的亲水性——因此能不能贴壁不仅仅关乎细胞是否有这种能力，也与有无合适的底物（培养瓶）有关。
大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长，在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。
● 贴壁的过程：细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（培养瓶，培养皿的底面）。然后，细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。
在了解不同细胞外基质对细胞粘附的效果是否一致之前，我们首先要来了解细胞是如何进行贴壁的！
✿ 细胞贴壁的过程（见图1）：
① 促细胞附着因子吸附于底物上
② 悬浮的圆形细胞与底物附着
③ 细胞将伸展成其原来的形态
细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质粘附在支持物的表面（培养瓶、培养皿的底面等），之后，细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。
图1. 细胞贴壁原理图 (美格生物)
通过上面我们了解了细胞贴壁，知道细胞会通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合，一起参与细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质（如：粘连蛋白、纤维连接蛋白等等），通常存在于培养液中。这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，细胞再与已吸附的有促贴附物质的底物附着，之后细胞将伸展成其原来的形态。所以细胞贴壁与否，不仅与细胞本身分泌细胞外基质的能力有关，而且与细胞本身表达的黏附分子的数量也有关，还和底物的表面结构有关。
✿ 哪些物质可以促使细胞贴壁？
① 胶原蛋白
胶原蛋白是支持细胞和组织生长的重要胞外基质蛋白，其形成的胞外环境有利于多种细胞的粘附、生长、迁移和分化。
② 纤粘连蛋白（Fibronectin，FN）
纤粘连蛋白是一种位于细胞表面和血浆中的大分子蛋白质，是一种主要的细胞黏附分子，在细胞纤维基质中发挥结构和黏附性作用。
③ 层粘连蛋白（Laminin）
层粘连蛋白是细胞外基质的重要组成，存在于所有上皮细胞和内皮细胞的基底侧，同时也是某些细胞与细胞间交互作用的中间媒介。层粘连蛋白有细胞及组织特异性，对于调节细胞功能具有重要作用，如：协助粘附、促进生长、引导迁移、调控分化、维持表型、防止细胞凋亡等。
④ 玻璃粘连蛋白（Vitronectin）
玻璃粘连蛋白属于小分子蛋白，借由Vitronectin 受体让细胞贴附于细胞基质中，主要促进细胞迁移，增加细胞贴附性、细胞分裂、细胞生长分化等，并协助细胞间的讯号传递。
2． 接触抑制（Contact inhibition）
细胞从接种到长满底物表面后， 由于细胞繁殖数量增多相互接触后， 不再增加。
一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长； 但是， 转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降， 他们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长。
图4. 细胞接触抑制的影响
3、 密度依赖性（Density inhibition）
3T3细胞系， 在细胞稀少状态下培养时， 其生长迅速； 但一旦细胞生长汇合成一片时（每6cm培养皿约10 6 个细胞） ， 其分裂增殖停止。 其确切的细胞密度常与培养液中的血清浓度有关。 上述这种生长特性即为密度依赖性调节（或密度抑制） 。
转化细胞或恶性肿瘤细胞则与正常细胞不同， 他们的密度依赖性调节常常降低， 因而可以生长至较高的终末细胞密度。
（三） 体外培养细胞的生长与增殖过程
1、 单个细胞的生长过程：
与体内细胞周期相似， 经历G1、 S、 G2、 M期(见图5)。
细胞的分裂周期长
细胞分裂时间为12～48h，
细胞的分裂周期=间期+分裂期间期（G1+S+G2）分裂期（M）
典型的人的体细胞的细胞周期时间为24小时
G1期约11小时
S期约8小时
G2期4小时
M期1小小时
G0期，也称静止期，细胞暂时离开细胞周期。细胞转化为G0期多发生在G1期。G0期细胞一旦得到信号会返回细胞周期。
图5. 细胞周期
各类细胞分裂周期时间表
细胞类别 细胞分裂周期时间/h
G1 S G2 M 合计
人胚肺成纤维细胞(WI-38) 8 8.0 4.0 0.8 20.8
人T细胞 10.5 7.6 3.2 0.8 21.1
急性淋巴性白血病细胞 >1~10d 20 2~3 1.0 >2~10d
小鼠腹水癌细胞 5.7 8.5 3.8 1 19
中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 4.7 4.1 2.8 0.8 12.4
中国仓鼠成纤维细胞 2.7 5.8 2.1 0.4 11
小鼠肿瘤细胞 - 12 6 0.5 18.5
小鼠成纤维细胞 9.1 9.9 2.3 0.7 22.0
2、 细胞系的生长过程：
体外培养细胞寿命的过程可分为三个阶段
(1) 原代培养期
(2) 传代期
(3) 衰退期
(1)原代培养期（初代培养）
为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶段,一般持续1~4周。
特点： 原代细胞培养通常为异质性， 细胞独立生存性差， 多呈二倍体核型， 更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性， 是检测药物的很好实验工具。
(2)传代期
当细胞持续生长增殖一段时间， 达到一定的细胞密度后， 就应当将细胞分离成两部分（或更多） 至新的培养器皿中， 并补充更新培养液， 此即为传代。
特点:在细胞整个生命期中此期的持续时间最长，一般情况下， 可传代10～50代。 细胞增殖旺盛， 并能维持二倍体核型， 被称为二倍体核型。
有限细胞系和永久细胞系
动物细胞离体培养起始物， 我们称之为原代培养（primary culture） 。 经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。
有限细胞系： 细胞自动物体内取出后， 在培养中仅持续生长有限时间， 然后将自行停止生长。 即使提供生长所需的营养物质（包括血清） ， 最终也会死亡。 这种
寿命仅能维持一段时间的细胞系， 称为有限细胞系。
大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖， 当超过有限世代后， 它们可能有两种情况， 一是衰老死亡， 二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。
有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)， 其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。
永久细胞系有如下特征： 细胞形态变化， 如细胞变小， 黏附性减少， 具有较高的核质比； 生长速率增加， 倍增时间缩短； 对血清的依赖性减小； 贴壁依赖性降低； 细胞异倍体和非整倍体增加， 细胞接种到体内后， 生癌率上升。
结果： 细胞群体中具有迅速增殖能力的细胞将渐占优势，而不增殖的或增殖缓慢的细胞将被减弱。
图6. 细胞培养生长曲线 magigen.com
(3)衰退期， 此期细胞虽仍存活， 但增殖基本停止， 细胞形态轮廓增强， 进而细胞发生衰退、死亡。
细胞在第二期末或第三期初阶段， 通过所谓“危机期” (crisis)， 获得不死性而具有持久或无限增殖的能力。 失去接触抑制。
3、 每代细胞的生长过程
在细胞的生长过程中， 繁殖到一定密度后， 将之分开而移至新的培养皿中称为接种。
细胞” 一代” ： 仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间。
每代细胞的生长阶段
潜伏期
指数生长期 停止期
培养细胞传代的生存期：
1)潜伏期(latent phase)
2)指数生长期(logarithmic growth phase)又称对数期--试验用
3)平台期又称生长停滞期(stagnate phase)。 -- --传代
1） 潜伏期
潜伏期特点:
潜伏期长短与细胞接种密度、种类、使用的培养基性质有关
(1) 细胞贴附后进入潜伏期, 细胞无增殖。少见分裂相，细胞有运动活动。
(2) 初代培养 细胞潜伏期约为24~96小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期约6~24小时
(3) 细胞接种密度大，则潜伏期短
2） 指数生长期
细胞增殖旺盛， 成倍增长， 活力最佳， 适用于进行实验研究。 持续3~5天。
细胞生长增殖状况可以细胞群体倍增时间及细胞分裂指数等来判断。 在此阶段， 若细胞处于理想的培养条件， 将不断生长繁殖， 细胞数量日渐增加。 细胞将接触而连成一片，
渐次铺满培养器皿底物， 提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失。 因接触抑制而细胞运动停止、 密度抑制而细胞终止分裂。 细胞不再繁殖而进入平台期。
3) 平台期
又称生长停滞期。
此期细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满， 细胞量和密度达到饱和， 细胞停细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖，细胞数量持平。
特点细胞虽已停止生长， 但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。 若及时分离培养、 进行传代， 将细胞分开接种至新的培养器皿，并补充以新鲜培养液， 细胞将于培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。 否则细胞因中毒而发生死亡。
注意:
传代过晚将影响下一代细胞的生长至少要再传1~2代,通过换液淘汰死细胞和受损较轻的细胞。待细胞全部恢复后再用。在这一点上要特别注意。
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