第一部分 RNAi实验基本概念

1. RNAi的概念

什么是RNAi?

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种由双链RNA（dsRNA）特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，进而介导转录后基因表达抑制的生物学过程。

2006年，安德鲁·菲尔和克雷格·梅洛因其发现“RNA干扰机制——双链RNA沉默基因”的贡献而共同荣获诺贝尔生理学或医学奖。

图1. RNi原理图      www.magigen.com

2. RNAi的启动途径

• dsRNA途径：在非哺乳动物系统中，大于30bp的长双链RNA(dsRNA)经Dicer酶水解成21-23bp的小干扰RNA(siRNA)，进一步触发RNAi。而在绝大多数哺乳动物系统中，超过30bp的dsRNA可能会激活潜在的抗病毒机制（干扰素效应），降解dsRNA。

• siRNA途径：21-23bp的双链siRNA解链并组装入RNA诱导的沉默复合体（RISC），其反义链引导RISC与mRNA分子互补配对，并降解mRNA，导致特定基因表达的抑制。

• shRNA表达载体途径：短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）通过表达载体在细胞内表达后，在Dicer酶的作用下形成siRNA分子，触发RNAi。这种方法可能会引入细胞毒性。

3. 非哺乳动物系统的RNAi实验

在非哺乳动物系统（如线虫、果蝇）中，可通过与靶基因序列互补的长链dsRNA（通常>200bp）介导RNAi的发生。长链dsRNA可通过体外转录获得，进入细胞后被Dicer酶水解为多个混合的siRNA，以增强敲除效果。

4. 哺乳动物系统的RNAi实验

• 通过转染siRNA：通常能在3-7天内维持较高水平的基因表达抑制。大部分RNAi实验可在这一时间内获得结果，并可通过再次转染获得超过1周的基因表达抑制。

• 通过转染shRNA表达载体：可以获得超过2周的基因表达抑制时间，适用于需要长效RNAi实验的情况。

5. RNAi效应表现

RNAi效应可在mRNA水平和蛋白质水平上体现，也可能影响细胞形态等生理学特征。

第二部分 RNAi实验具体设计

1. 需要短期抑制还是长效抑制?

• 1周以内：采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，并可通过两次转染的方法延长RNAi作用时间至2周。

• 2周以上：采用shRNA表达载体较好，因为效应持续时间较长。

2. 采用siRNA进行实验的途径

• 化学合成：首选方法，最快、最方便，但成本较高，适用于长期使用特定siRNA。

• 体外转录：耗时，成本较低，所需有效浓度较低，适用于大量筛选siRNA。Silencer® siRNA Construction Kit（ThermoFisher）可用于此目的。

• Dicer/RNaseⅢ酶解：非哺乳动物系统的RNAi方法之一。

3. 构建shRNA表达载体进行实验

构建相关质粒时可利用载体上的抗生素标记进行筛选，实现长效表达。但是无法进行荧光标记，因此无法直观了解转染效率。

4. siRNA设计需要注意的问题

• siRNA序列设计：理想的siRNA序列应具有高度特异性，并能高效抑制目标基因。

• 阴性对照siRNA的作用：阴性对照siRNA用于反映小分子RNA片段进入细胞后对基因表达的非特异影响。

• 阳性对照siRNA的重要性：用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条件和检测方法是否可行。

• siRNA荧光标记的问题：荧光标记的siRNA可用于确定转染效率和优化转染条件，但摄入与抑制效果之间可能存在不相关性。

5. RNAi Off-target（脱靶效应）

• 定义：指siRNA转染中的非特异反应，不仅包括siRNA序列，还包括转染试剂本身或其他因素导致的非特异性基因表达变化。

• 检测：常用方法包括基因表达谱芯片等。

• 与siRNA浓度的关系：高浓度和低浓度都可能产生脱靶效应。

• 转染试剂的影响：某些转染试剂可能会影响细胞基因表达，导致假阴性或假阳性结果。

• 避免策略：设计至少两条抑制效率高于70%的不同siRNA序列，采用不同转染试剂进行实验。

6. 转染是RNAi实验的瓶颈

• 原则：高转染效率、低细胞毒性、简便的操作方法、较低的成本。

• 方法：主要采用化学方法，对于化学方法难以转染的细胞，则采用电穿孔等物理方法。

• 试剂类型：

  • 脂质体类：如Invitrogen公司的Lipofectamine™ 2000/3000和RNAiMAX。

  • 非脂质体聚合物类：如Merck公司的NanoJuice® Transfection Kit、Qiagen公司的HiperFect、Clontech公司的Xfect™、Micropoly公司的Micropoly-transfecter™ Cell Reagent、Engreen Biosystem公司的Entranster™-R等。

  
  

第三部分 siRNA转染过程相关问题及解答

1. siRNA转染过程相关问题

• 转染细胞数量：转染时细胞的汇合度建议为20%-40%，以利于提高抑制效率。

• siRNA工作浓度：需根据实验优化确定，一般有效浓度范围为10nM-200nM。

• 转染时血清的问题：一些转染试剂要求在转染前后使用无血清培养基。

• 转染时抗生素的问题：一些转染试剂（如脂质体）要求转染时不添加抗生素。

• 转染过程：按照不同转染试剂提供的协议操作。

• 转染后换液的问题：某些情况下，转染后4-6小时需要更换培养基以减轻细胞毒性。

• 转染条件优化：优化转染试剂用量、siRNA用量、细胞密度等，以达到最高基因抑制效率并降低细胞毒性。

• RNAi效应检测方法：mRNA水平可通过qRT-PCR检测；蛋白质水平可通过Western Blot、免疫荧光或流式细胞术检测；生物学效应则可通过细胞学、酶活性或芯片分析等方式评估。

2. siRNA转染疑问解答

问：siRNA转染和质粒DNA转染有何不同？

答：

• siRNA转染主要用于抑制性实验，而质粒DNA转染多用于过表达实验。

• siRNA长度较短（21-23bp），而质粒DNA长度较长（通常超过5kb），因此所需的转染载体不同。

• siRNA更易降解，因此对转染条件的要求更为严格。