逆转录PCR/RT-PCR的原理、实验步骤和参数设置
什么是逆转录PCR?
逆转录PCR, 又称反转录PCR，英文Reverse Transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶链式反应PCR的一种变形。
注意：实时PCR的简称也是RT-PCR, 注意区别。本文所指的RT-PCR是逆转录PCR.
在逆转录RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
逆转录PCR(RT-PCR)的原理
逆转录PCR(RT-PCR)灵敏性高、操作简单点，经常用于生物学检测、基因定量分析、克隆目的基因等。
图1. 逆转录RT-PCR原理图
cDNA的合成是RT-PCR的重要环节。以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA( complementary DNA，cDNA)，再按照普通PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，则可扩增出不含内含子的可编码完整基因的序列。
由于不同mRNA拷贝成cDNA的效率不同，适合于一种mRNA拷贝的条件可能对另一种mRNA不适合，需要有不同的配置。一般来说，从事不均一mRMA群体时，所使用的条件目的是让cDNA合成的终产量达到最大。为此，下述参数十分重要。
逆转录PCR主要参数设置
1. 逆转录酶，有两种不同的逆转录酶可以催化以mRNA为模板，oligo(dT)作为引物，合成与mRNA互补的cDNA链。
A. 来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的rna酶H活性，它最适温度是42℃，最适pH8.3。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。另外，禽源逆转录酶制剂可被能切割DNA的核酸内切酶污染。
B. 来源于鼠白血病病毒(Mo-MLV)，是单肽链的，有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性，最适温度37℃，最适pH7.6，较弱的RNA酶H活性对获得2-3kb的mRNA的全长cDNA有很大好处。在第一链反应前可用氢氧化甲基汞处理，破坏mRNA的二级结构，这一步对于最适反应温度较低(37)℃的鼠源逆转录酶催化的反应可能更为重要。临合成cDNA第一链之前加入过量的巯基试剂，可以使氢氧化甲基汞从RNA上解离。
2. 单价阳离子, 离子条件基本上影响各种模板的转录效率。用钾比用钠离子可获得较长的转录产物。对于cDNA长度的最适钾离子浓度为140-150mM。
3. 二价阳离子, 对于反转录酶活性来说，二价阳离子是必需的。低于4mM Mg2未能观察到活性; 产生全长转录产物的最适浓度是6-10mM。
4. 脱氧核苷三磷酸, 使用四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)中每一种的高浓度对于有效合成cDNA是特别重要的。如果其中只有一种的浓度下降到10-50微摩尔以下，全长转录物的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-250微摩尔。
逆转录PCR实验材料和实验步骤
1.材料: RNA样品。
2.仪器、用具: PCR仪、电泳仪等、0.2mlPCR管(1个)、移液器、碎冰。
3.试剂: RNase Free dH2O；5×RT Buffer(含25mM Mg2)；dNTP(10mM each)；RNase Inhibitor(10U/μl)；Oligo(dT)20(10μmol/L)；ReverTra Ace。
4.方法
（1）以总RNA为模板，合成cDNA第一链。
（2）反转录反应条件为：30℃10min，42℃30min，99℃5min，4℃5min。反应结束后冰浴5分钟。
5. 逆转录PCR注意事项
cDNA第一链合成的反应液冰上配制。
使用ReverTra Ace、RNase Inhibitor等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
逆转录PCR时，提取RNA是关键，收集RNA沉淀时，离心速度不要低于13000rpm，在离心前的沉淀也尽可能在低温下条件下操作，此外逆转录酶可以选择MMLV逆转录酶，主要是因为这个条件比较容易掌握。
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