CRISPR/Cas蛋白

大家好，前面我们讲了CRISPR CAS12a切割原理的第一部分，现在我们继续讲CAS12a切割原理的第二部分。

CRISPR Cas切割原理二

图A. AsCas12a结构域。在域下面标识的数字是每个域的最后一个残基位置。

尽管研究表明，最好的方式是比较两种核酸酶的DNA监测，但与CRISPR Cas9相反，Cas12a RNP似乎在其对原型间隔区的查询期间，采用间歇性接触方式跟踪DNA。CRISPR Cas12a酶识别置换链上富含T的PAM上游的目标序列（例如AsCas12a的5'-TTTV）（图B）。Cas12a的富含T的PAM扩展了CRISPR Cas9对应的目标空间。

图B. Cas12a RNP形成的R回路示意图。R环的形成方向用虚线箭头表示。DNA中RuvC的大致切割位置用深蓝色三角形表示，但两条链都是被一个催化位点切割的。

‍Cas12a蛋白结合PAM直接导致PAM下游靶序列DNA的局部熔化。这可以让下游序列与crRNA寻求互补。

crRNA碱基与DNA靶链配对，进一步融合DNA，将异源双链体延伸至PAM远端，最终形成完整的R-loop（图B）。

这种定向性形成一个PAM近端种子区域，其中的错配会对结合和切割带来更多的不利。

然而，与CRISPR Cas9蛋白相比，CRISPR Cas12a蛋白需要crRNA和目标DNA之间更多的匹配碱基才能稳定结合。特别是，CRISPRCas12a对PAM远端错配的耐受性远低于CRISPR Cas9。

因此，就像在体内观察到的，CRISPR Cas12a蛋白具有不太明显的种子区域，并提供更多的特异性。只有当目标DNA和crRNA足够互补时，Cas12a RNP才能形成稳定的R环结构，从而实现DNA切割。

与CRISPR Cas9蛋白不同，CRISPR Cas12a蛋白可能使用单个RuvC核酸酶结构域切割两条DNA链。人们最初认为Cas12a RuvC结构域首先切割置换的链，通常在PAM下游的第16和第17个核苷酸之间，然后继续切割第23和第24个核苷酸之间的目标链。然而，现在发现初始切割位点略微不同，并且认为也发生随后的修剪。Nuc结构域似乎涉及将目标链DNA定向到靠近RuvC结构域中的活性位点。这得到以下观察结果的支持：Nuc结构域中的突变（CRISPR AsCas12a蛋白的R1226A）阻止目标链的切割，有效地将Cas12a转化为切口酶。

因此，CRISPR Cas12a蛋白诱导具有可变长度的5'突出端的PAM远端切割。值得注意的是，CRISPRCas12a蛋白在种子区域外切割，而Cas9在其种子区域内切割。正因为如此，Zetsche等人提出Cas12a的DNA切割可以耐受由非同源末端连接NHEJ方式产生的小插入缺失，导致多轮双链断裂形成，因此增强了
同源重组发生的机会。然而，鉴于CRISPRCas12a观察到的高体内特异性，现在看来这似乎不太可能。

切割后，Cas12a RNP保持与PAM近端切割产物结合。这使得随后与RuvC催化位点的相互作用，置换链被修剪。与CRISPR Cas9蛋白与其切割产物的相对稳定的相互作用相反，Cas12a PAM远端切割产物在切割后容易释放。

PAM远端DNA的这种释放可能允许ssDNA分子与仍然活跃的RuvC结构域相互作用，这可能解释了在切割初始特异性dsDNA靶标后，Cas12a观察到的ssDNA的非特异性切割活性。

这种有条件的ssDNA附带活性不太可能有什么问题，因为DNA在体内几乎不以单链状态发生。实际上，在某些情况下，已发现Cas12a蛋白的毒性低于Cas9蛋白。

CAS12a切割原理总结

CRISPR–Cas12a蛋白，以前称为Cpf1，是一种原核脱氧核糖核酸酶，可以通过向导RNA进行编程，以靶向互补的DNA序列。在与靶DNA结合后，CRISPRCas12a蛋白在每条靶DNA链中诱导切割，产生双链DNA断裂。除了诱导靶DNA的顺式切割之外，靶DNA结合还诱导非靶DNA的反式切割。因此，CRISPR Cas12a-RNA向导复合物可以提供针对入侵核酸（例如噬菌体和质粒）的序列特异性免疫。类似于CRISPR–Cas9，Cas12a已被重新用作原核和真核细胞中可编程基因组编辑和转录控制的遗传工具。此外，其反式切割活性已应用于高灵敏度核酸检测。尽管Cas12a在这些应用中具有证明的价值，但DNA的顺式和反式切割的确切分子机制尚未完全了解。最近的研究揭示了CRISPR Cas12a蛋白介导DNA切割的机制细节：向导RNA和靶DNA的碱基配对诱导Cas12a的主要构象变化。这些构象变化使Cas12a蛋白处于催化活化状态，其中它充当脱氧核糖核酸酶。该脱氧核糖核酸酶活性首先介导置换的靶DNA链的顺式切割，其次介导RNA引导结合的靶DNA链。由于CRISPRCas12a蛋白在顺式切割后保持催化活化状态，随后证明了非靶DNA的反式切割。

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