细胞培养是一项细致而艰难的工作，在细胞培养过程中，要特别注意防止微生物污染，一旦细胞被微生物污染，轻则珍贵的要被细胞废弃，重则连累整个培养箱，甚至培养室！

如何防止细胞被微生物污染？

细胞污染的表现和微生物污染分类

细胞污染是什么样子？

一、细菌污染

细菌污染是细胞培养中最常见的污染，其污染主要来源于实验室环境、实验人员、实验服、实验用具等，甚至在细胞培养过程中添加抗菌素（一般为预防剂量），也可能因为操作不慎而引起污染。

种类：造成细菌感染最常见的有革兰氏阳性菌如枯草杆菌、葡萄球菌等；大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌也会造成细菌感染。

特点：细菌污染的培养液通常会出现浑浊、PH下降，也有少部分会出现培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染情况，建议每天仔细观察；被污染的细胞在显微镜下可以观察到细胞胞浆出现大量颗粒，细胞变圆或者崩溃，从壁上脱落死亡。一般细菌污染进程很快，大约污染一两天后肉眼就能显著观察到变化。

图1. 球菌和杆菌感染细胞

二、真菌污染

真菌污染是细胞培养过程中最常见的另一种污染，尤其在霉雨季节，霉菌污染尤为严重。另外由于真菌可以通过孢子繁殖，因此一旦污染很容易发生扩散。

种类：常见的真菌感染有烟曲霉菌、黑曲霉菌、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌污染等。

特点：霉菌污染的细胞培养液短期内一般不会浑浊，可在培养液表面形成白色或黄色漂浮物（斑点状，易于观察）；高倍镜下可见明显的丝状、管状或是树枝状的菌丝纵横交错在细胞间；念珠菌和酵母菌污染一般会成卵圆形散在细胞周边，并且酵母菌污染会导致培养液浑浊。真菌污染会与细胞抢夺营养，还会释放次级代谢物毒害细胞，造成细胞活力变差，生长速度变慢，甚至死亡。

图2. 被酵母菌和霉菌感染的细胞

三、支原体污染

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间，并独立生活的原核微生物，广泛存在于人和动物体内。

种类：细胞培养中常见的支原体有口腔支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、肺炎支原体和发酵支原体，其中前四者占据支原体污染的绝大比例。

特点：支原体大小为0.1-0.3µm，可以轻易通过我们常用于除菌的0.22µm和0.45µm孔径滤膜；并且在常规光学显微镜下无法观察到，荧光显微镜下可用DAPI染色观察到支原体污染；此外支原体无细胞壁，可以直接且紧密结合宿主细胞细胞膜，适当条件下可能导致细胞融合。

支原体污染具有隐蔽性，他们可以与细胞长期共存，培养基一般不浑浊。大部分细胞被污染后似乎无明显变化，但其实支原体会抑制细胞生长，并且导致染色体畸变等，对细胞培养实验影响巨大。

图3. 支原体感染的细胞前后对比图

四、黑胶虫污染

黑胶虫是一种生物还是非生物，学术界至今还有争议。这里我们暂且将其认作是一种微生物。黑胶虫污染主要来源于血清。

特点：黑胶虫污染起初对细胞并无影响，当达到一定数量时则会影响细胞生长。受黑胶虫污染的细胞液通常清亮无变化，在高倍显微镜下可以观察到点状片状的游动小体，做布朗运动。

图4.   透射电镜和光学显微镜下观察的黑胶虫

五、病毒污染

病毒作为一种比支原体更小的微生物，体型在nm级，很难用常规方法检测到。病毒污染分为外源性和内源性，污染主要来源为细胞系，常见于杂交瘤细胞。

特点：病毒污染的细胞液通常清亮无变化，大部分被污染的细胞也不会产生形态及病理现象，小部分病毒会造成细胞变圆、肿胀、脱落。

病毒污染可用血细胞吸附实验、免疫荧光抗体法以及电子显微镜法检测，但其清除是十分困难的，一旦不幸被污染，建议直接重新引入高质量细胞株。

微生物污染预防

微生物污染在细胞培养中是非常常见的，也是令人头大的一件事情。所以我们一定要将问题扼杀于摇篮之中，规范实验中的各个步骤，确保细胞“宝宝”在无污染的情况下健康成长。

1．实验进行前，准备好所需的试剂和器材。玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒：

1)高压蒸汽灭菌15分钟以上；

2)干烤消毒140℃2小时以上。

2．培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验：将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4℃保存。

3．消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20℃保存。

4．超净台用紫外灯照射30-60min，并开启超净台风机运转5-10min，然后用75%酒精擦拭超净台台面，再开始实验操作。

5．实验进行时，佩戴好口罩及手套，穿上洁净实验服，有长发则将长发扎起或者佩戴帽子，避免灰尘或唾液进入培养物中。

6．进入超净台前应用75%酒精对双手及手腕进行全面擦拭，确保除菌完全。

7．实验用品用75%酒精擦拭后才能放入超净台内。

8．操作时小心取用无菌物品，应避免污染。勿碰触吸管尖头，不小心碰触后应立即更换；手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，容器打开后，倾斜45度操作，操作完成后及时盖上瓶盖。

9．每次操作只处理一种细胞；即使不同细胞使用相同的培养基也不要共享同一瓶培养基，避免细胞间的交叉污染。

10．实验用品用完应移出超净台，以利于空气流通；实验完成后用75%酒精擦拭超净台台面。

11．定期清洗或更换超净台过滤膜、预滤网。

12．此外CO2培养箱的清洁是较易被忽视的地方，应1-2个月对培养箱定期进行清洁消毒。先用75%酒精擦拭培养箱内壁、隔板、水盘2-3次，用双蒸水清洗，再用酒精棉球擦拭一遍，最后紫外灯照射1h以上或进行高温高压灭菌处理。水盘内加入无菌水（应每周更换），待培养箱内温度、湿度、CO2浓度稳定后再放入细胞。

细胞污染了怎么补救？
细胞污染处理方法

微生物污染去除

首先，我们要知道，在任何情况下，完全去除细胞中的微生物污染是非常困难的！因为不管是哪一种操作，对细胞的生长而言都是一种额外刺激，很有可能导致细胞状态改变甚至死亡；而过度使用抗生素可能产生更强抗性的菌株，撤药后极易复发。

所以，对于易于重新获得的细胞株，我们建议直接处理培养物，不分敌我全部消灭，防止感染扩散！对于极为珍贵的细胞样本，我们可以尝试以下处理方法进行挽救。

如何去除细胞污染？

一、细菌、真菌污染处理方法

1. 用DBSS洗细胞（稀释污染物）：

(a). 对于单层细胞，用DBSS浸洗培养物3次，胰蛋白酶消化，通过离心重悬用DBSS再洗细胞2次；

(b). 对于悬浮细胞，通过离心重悬用DBSS洗培养物5次。

2. 在新培养瓶以最低可行种植密度再接种。

3. 加入高浓度抗生素培养基，每2天换液。（一般在正常工作浓度的5-10倍，建议做梯度实验确保对污染物杀伤力较大，对细胞影响较小）

4. 用高浓度抗生素培养基再培养。

5. 重复步骤1~4，进行3次再培养。

6. 去掉抗生素，在无抗生素培养细胞的状况下再进行3次再培养。

7. 通过相差显微镜检查培养物并进行Hoechst染色。

8. 在无抗生素的条件下再培养细胞2个月，检查确定所有污染已被移除。

细胞培养正常抗生素浓度推荐表

（数据源于参考文献1）

二、支原体污染处理方法

1. 用D-PBSA洗涤细胞（稀释可以减少污染物数量）：

(a).对于单层细胞，用D-PBSA浸洗培养物3次，胰蛋白酶消化，通过离心重悬用D-PBSA再洗细胞2次；

(b).对于悬浮细胞，用D-PBSA离心重悬洗涤细胞。

2. 以高种植密度接种1个或者多个新培养瓶。

3. 加入高浓度抗生素培养基，每2天换液。

4. 用高浓度抗生素培养基再培养，如果不同类型的抗生素与BM-Cyclin交替使用，细胞应在应用新抗生素前换液。

5. 去掉抗生素，在无抗生素培养细胞的状况下培养细胞至少2周。

6. 用PCR或者其他支原体检测方法检测培养物。

7. 在无抗生素的条件下再培养细胞2个月，检查确定所有污染已被移除。

支原体去除抗生素浓度推荐表

（数据源于参考文献1）

三、黑胶虫污染处理方法

上面提到黑胶虫污染主要源于血清，故实验时尽量采用质量和口碑较好的血清培养。 黑胶虫早期污染一般采用如下方法：

1. 用0.25%的胰酶消化，当有少量细胞变圆或脱壁时，用血清终止消化；

2. 轻轻用培养液或D-Hanks液清洗3遍（缓缓流过细胞表面），不要吹打，吹散细胞；

3. 换培养瓶培养，隔天换液，2天后重复一次；

4. 此后每24-36h换液一次，一周后，黑点基本消失。

上述污染去除方案均是在细胞极其珍贵情况下的无奈之举，在细胞易于获得的情况下还是建议大伙儿直接处理掉污染的细胞，重新以新批次细胞进行试验，不仅节约时间，而且风险更小。

参考文献

1. R. Lan Freshney著，章静波，徐存拴等译. 动物细胞培养——基本技术和特殊应用指南（第七版）.科学出版社，2020. magigen.com

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