如何进行蛋白纯化？蛋白纯化方法大全
什么是蛋白质纯化？
蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
如何进行蛋白质纯化？
蛋白质纯化是在实验室中常见的操作，纯化蛋白常用的方法有一下几种。
一、沉淀法纯化蛋白
1.盐析：在蛋白质水溶液中加入中性盐，随着盐浓度增大而使蛋白质沉淀出来。
盐解离产生的离子争夺了溶液中大部分自由水，从而破坏蛋白质的水化作用，引起蛋白质溶解度降低，故从溶液中沉淀出来。而且盐的解离可抑制蛋白质弱电解质的解离，使蛋白质带电荷减少，更容易聚集析出。
2.等电点沉淀法：利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。
在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子静电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀。
3. 有机沉淀法：与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低而沉淀。
加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低，因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。
二、层析纯化蛋白
1.离子交换色谱层析：以离子交换树脂或化学键合离子交换剂为固定相，利用被分离组分离子交换能力的差别或选择性系数的差别而实现分离。
当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，因此也可以全部被交换而吸着在交换剂上。融合的蛋白质能够根据逐渐提升过柱液中的含盐量或者提升过柱液的pH值过柱出来。
2.疏水相互影响层析：疏水层析是利用蛋白质在高盐条件下吸附在疏水层析介质的疏水基团上，降低盐浓度时，不同蛋白按疏水性从弱到强依次被洗脱，从而达到分离纯化的目的。在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，而其他的杂蛋白则没有此种性质。
图. 疏水相互作用层析
蛋白质表面一般有疏水与亲水基团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。
3.亲和层析：利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。
图. 亲和层析原理图
当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出。
4.凝胶层析：混合物随流动性相流过配有凝胶固定不动相的层析柱时，在其中各成分因分子大小的不一样而被分离的技术性。
越小的蛋白质，需要连续不断地穿入珠子的内部，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。
三、离心式蛋白纯化
1.速度区带离心分离：当不同的颗粒间存在沉降速度差时，在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带。
此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关。大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。
2.差速离心法：采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
四、膜分离技术蛋白纯化
1.超滤膜法：在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。
在超滤过程中，由于被截留的杂质在膜表面上不断积累，会产生浓差极化现象，当膜面溶质浓度达到某一极限时即生成凝胶层，使膜的透水量急剧下降，这使得超滤的应用受到一定程度的限制。
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