Taq DNA 聚合酶的历史

1976年, 科学家A. Chien从美国黄石国家森林公园的火山温泉中一种叫做水生栖热菌（Thermus aquaticus，英文缩写Taq）的嗜热细菌中分离出一种耐热的 DNA聚合酶。这种嗜热细菌生长在70-75℃极富矿物质的高温环境中。因此，Taq DNA聚合酶具有极高的热稳定性，能够承受PCR的热变性步骤。

1986年，Kary Mullis发明了PCR技术，从此开启了现代分子生物学的大门。当时，由于使用的是大肠杆菌聚合酶I（Klenow），每个循环都需要补充新的聚合酶，操作十分麻烦。

1988年，Saiki等将一种从Thermus aquaticm分离出的耐热型DNA 聚合酶用于PCR技术，不但实现了PCR过程自动连续循环，还因为提高了退火和延伸温度而提高了产物特异性。这个耐热DNA聚合酶就是著名的Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶的发现，使PCR变成一种便利的、普遍的实用分子生物学技术。这个研究鼓励了更多的技术人员使用Taq DNA聚合酶进行PCR。

1989年，Lawyer等利用特异性探针从Taq DNA聚合酶基因文库中钓取了Taq DNA聚合酶全长基因，最终得到一个2496bp的编码序列，GC%高达68%，他们将该基因克隆到大肠杆菌中，通过诱导表达和分离纯化得到纯的Taq DNA聚合酶。

30多年来，越来越多的其它的优秀的耐热型DNA聚合酶用于PCR技术，比如Pfu系列、Vent系列、KOD系列，但Taq DNA聚合酶始终是PCR聚合酶的主力军。到目前，Taq仍然是市场份额最大，种类最繁多，应用最广泛的热稳型DNA聚合酶。Taq聚合酶缺乏3' - 5'校正活性，但具有5'-3'外切活性和末端加A的特点，在sanger测序、qPCR、TA克隆等领域具有独特的应用。同时，研究人员对Taq DNA聚合酶的改造也从未停止，这正是Taq DNA聚合酶在PCR应用中生生不息的根本动力。

TaqDNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，属于DNA聚合酶I家族。Taq DNA聚合酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa，预测的等电点约为6.0，理论总平均亲水指数为-0.282，其比活性为200000单位/mg。75～80℃时，每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒。温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性。Taq酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成， 但却有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下，仍能保持较高的活性。实验表明，在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和5～6min后，仍可保持50%的活性。PCR反应时，变性温度为95℃～20秒，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性， 其作用于类似逆转录酶。此活性温度一般为65～68℃，有Mn2+存在时，其逆转录活性更高。

Taq DNA聚合酶的特点

• 良好的耐热型，最适催化温度在75-80℃，95℃半小时后仍保留50%以上的活性。Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖型聚合酶，最适浓度范围是2-4mM。Taq DNA聚合酶还需要单价阳离子，在10-55 mM KCl中具有最大活性。有研究认为Na+会抑制聚合酶活性，但有些研究中聚合酶在Na+环境中也能够正常扩增。
  

• 5'-3'聚合活性，该特性对温度具有较高的敏感性，70℃时，Taq DNA聚合酶能够以60nt/s的速率聚合DNA链，55℃时降为24nt/s，37℃时为1.5nt/s，22℃时基本停止扩增（Innis, 1988）。
  

• 5'-3'外切核酸酶活性，Taq DNA聚合酶是少数具有这一活性的DNA聚合酶之一。1991年，Holland等（Holland, 1991）利用Taq DNA聚合酶的5'-3'外切活性切除5’端放射性标记的DNA探针，通过放射性信号的变化，实现PCR产物的特异性检测。这一研究，为qPCR技术的发展奠定了基础，从此，Taq DNA聚合酶也成了探针法qPCR技术的指定聚合酶。
  

• 部分PCR产物3’末端加A，1988年，Clark等发现Taq DNA聚合酶会在新生链的3’末端添加无模板核苷酸，这一特征使Taq DNA聚合酶的PCR产物能够直接用于TA克隆。但是实际应用时，情况要复杂得多， 1993年，Hu等报道了8种聚合酶3’末端延伸的情况，发现Taq DNA聚合酶在PCR产物的3’末端添加A或其它碱基。1996年，Magnuson等系统性研究了Taq DNA聚合酶3’末端加A的概率，发现3’末端加A并不高，与反向引物5’端碱基种类密切相关，他们还指出这种不完全的碱基添加不利于在等位基因分形和TA克隆。
  

• 无3'-5'校正活性，虽然Taq DNA聚合酶与大肠杆菌聚合酶I有很高的结构相似性（包括3’-5’外切核酸酶结构域），但它缺乏3'-5'外切核酸酶活性，这降低了其在PCR扩增中的忠实性。关于Taq DNA聚合酶的错误率，不同的报道差异很大，Tindall等（Tindall, 1988）测定的突变率为1/9000，Cline等（Cline, 1996）测定的突变率为8.0±3.9×10-6。这种差异的原因有两个：一、测试方法不同，比如lacZα和lacI，二、酶纯度和实验条件有差异。抛开这些错误率数据，实事求是的讲，我使用Taq DNA聚合酶多年，用于一般性扩增保真性还可以，一般1-2.5kb的目标片段，挑取两个克隆基本能得到正确的克隆。用于困难模板扩增时，错误率较高，挑取4-6个克隆子基本也能得到正确克隆。
  

注意：

因为可能使用的酶纯度不同，或者使用的buffer不同，模板、引物、仪器、反应体系、甚至PCR管壁的薄厚都会导致PCR表现的差异，上述所列的酶的催化性能参数，在不同的研究中是有较大变化。这些数据只是一个参考，实际使用中应以试验结果为准。

Taq DNA聚合酶的结构与主要功能

Taq DNA聚合酶属于聚合酶家族A，是一个单体酶，它与大肠杆菌聚合酶I（pol I）具有很高的结构同源性。1995年，Kim等公布了Taq DNA聚合酶的晶体结构，为解释其耐热性、催化活性及分子改造奠定了基础，下面将其结构特点罗列如下：

图. Taq DNA聚合酶的三维结构（Kim, 1995）

• Taq DNA聚合酶包括三个结构域，1-291：5'-3'外切核酸酶结构域，292-423：该结构域对应于pol I的3'-5'外切酶结构域，两者虽然具有结构相似性但无序列同源性，因此Taq DNA聚合酶不具有3'-5'外切活性，424-832：5'-3'聚合活性结构域。

• 5'-3'外切结构域是一个功能完整的独立结构域，该结构域的缺失不会使Taq丧失聚合活性，但对酶的催化性能有一些影响。Barnes（Barnes, 1992）构建了一个N端236aa缺失的Taq突变体，发现仍具有完整的聚合活性，且保真性有所提高。Lawyer等（Lawyer, 1993）发现N端289aa缺失的大片段耐热性比全长酶更高，且盐离子耐受能力也提高了，但持续合成活性降低十倍。Merkens等（Merkens, 1995）认为Klentaq持续合成能力的下降与5'-3'外切结构域结合DNA有关，结合作用阻止了酶与DNA底物的彻底解离，后来很多研究人员也支持这一观点。此外，5'-3'结构域还对Taq DNA聚合酶的底物特异性有很大影响，5'-3'结构域删除片段对引物3’端错配敏感性显著下降，对ddNTP的掺入能力增强。从三维结构上看外切结构域与聚合结构域距离很远（大于70Å），很难理解它是如何与聚合结构域协作的，Kim等也无法解释这个现象，他们推测5'-3'外切结构域在溶液中的位置与晶体中不同，要更接近聚合结构域。
  

• Taq DNA聚合酶3'-5'外切酶结构域比pol I短，缺少4个长度8-27aa的loop结构，并且pol I中担负金属离子结合的关键残基D424、D501、D355、E357在Taq中被替换为L356、R405、G308、V310，酸性残基上的羧基能够与金属离子形成离子键，被替换后无法再与金属离子结合，Kim等推测这是Taq DNA聚合酶失去3'-5'外切酶活性的主要原因。
  

• 5'-3'聚合活性结构域像一只右手，包括拇指(Thumb)、手掌(Palm)、手指(Fingers)结构，催化活性位点是Asp610、Asp785和Glu786位于Palm结构域中，手指结构中的O-α螺旋对底物特异性有重要作用，拇指结构中的I-α螺旋也和底物结合密切相关。
  

图. Klentaq1-DNA复合物结构（Eom S H, 1996）

Taq DNA聚合酶的应用

PCR技术改变了现代分子生物学，而Taq DNA聚合酶改变了PCR。随着技术不断的发展，PCR又细分为功能各异的种类，分别应用于不同的领域。在有些领域，比如高保真扩增，Taq DNA聚合酶被具有校正活性的酶取代，有些领域，如直接PCR、等位基因检测等领域，Taq DNA聚合酶还具有重要的应用，还有些领域，如Sanger测序、探针法qPCR、TA克隆，Taq DNA聚合酶仍不可替代。

• 热循环PCR

  Taq DNA聚合酶具有良好的热稳定性，能够承受热循环PCR的温度变化，不需要再人为的补充聚合酶，有利于自动化扩增，并且可以在较高温度下进行退火和延伸，能够提高PCR的特异性，因此被广泛采用。随着越来越多的其他来源的DNA聚合酶被发现，Taq DNA聚合酶受到了严重的冲击，不过由于Taq DNA聚合酶廉价易得，产品种类齐全，在一般的检测性PCR，插入基因鉴定，基因编辑检测等领域，仍具有十分广泛的应用。

• 易错PCR
  

  易错PCR是一种常用的基因随机突变方法，在酶的分子改造领域具有重要应用。聚合酶在高浓度Mg2+或者Mn2+存在条件下，延伸错误率概率显著提高，所得目标产物形成含有随机突变的DNA文库。Taq DNA聚合酶因为缺乏3’-5’校正活性，正适合易错PCR技术，虽然通过功能结构域缺失，Pfu(exo-)、Vent(exo-)也可以应用于易错PCR，但大多数报道中都采用Taq DNA聚合酶。

• 热启动PCR
  

  利用Taq DNA聚合酶进行PCR时，在较低的温度下（20-40℃）酶仍具有一定的聚合活性，此时引物容易非特性退火，因此容易产生干扰产物，甚至导致目标序列扩增失败。1991年，D'Aquila等发现将PCR试剂与模板分别加热到较高温度再混合，能够提高PCR产量及专一性，为热启动PCR奠定了基础。1994年，Sharkey等（Sharkey, 1994;Scalice, 1994）发现一种抗体TP7，能够在低温下抑制Taq DNA聚合酶，高温变性后完全释放出Taq DNA聚合酶的活性，明显降低了非特性扩增的发生。后来，研究人员又发现了冷敏感的Taq DNA聚合酶突变体，在低温下活性极低，高温下又能够正常扩增。研究人员还发明了类发卡引物、双链引物、热活性引物，避免引物提前退火，进一步减少了PCR 的非特异性扩增。Taq DNA聚合酶热启动产品，目前在市场上还有很大占比，而且为其他DNA聚合酶的同类产品研发提供了思路。

• 位点特异性PCR（SNP检测）
  

  3’-5’校正活性的缺失限制了Taq DNA聚合酶的应用，但这种缺陷使Taq DNA聚合酶正好可以用在单核苷酸多态性（SNP）检测上。1992年，Huang等发现Taq DNA聚合酶因为缺乏3’-5’校正活性，在扩增3’端错配引物时，效率显著降低（见下图）。

  

  图.   引物/模板错配（横坐标）与延伸效率（纵坐标）（Huang M M, 1992）

  在进行SNP检测时，只要把引物3’端设计在等位基因处，匹配的模板能够正常扩增，不匹配的模板就无法扩增或产量很低，根据核酸电泳或者qPCR检测，进行基因型区分。不过这种方法也有缺陷，虽然有些错配（比如A/C、T/G）延伸效率降低，但仍能产生PCR产物，干扰检测结果，研究人员对此进行了一系列的改进优化，准确性得到了很大的改善（Ahmadian, 2001; Germer, 2003; Gaudet, 2009）。不过由于测序技术的普及，用测序法进行基因分型和SNP检测更加准确，但更高的成本、耗时等缺陷还是有一定限制，基于Taq DNA聚合酶的PCR/qPCR试剂盒在该领域发挥着主要作用。

• qPCR（Taqman法）
  

  qPCR按照检测模式的不同可以分为荧光染料法、Taqman探针、分子信标和双杂交探针，分子信标本质上也是一种探针，本文将其和Taqman统称为探针。荧光染料法是基于SYBR green I与dsDNA的无差别结合，因此(SYBR)qPCR对DNA聚合酶基本没有要求，探针法基于聚合酶5’-3’外切活性对5’端荧光报告基团的切割，因此只能用Taq及其衍生酶。

  

  图.   Taqman qPCR与SYBR qPCR的区别

• TA克隆

  向PCR产物3’端无模板依赖添加脱氧核糖核苷酸不是Taq DNA聚合酶特有的性质，测序酶、pol I（强），Vent（弱）都有这个特点，但适合耐热性PCR的只有Taq系列。前面已经做过介绍，Taq DNA聚合酶3’末端加的不一定都是A，而且概率也不高，跟反向引物的5’端碱基有关，但PCR产生的巨大数量的拷贝能够确保每一种基因型产物都得到有效克隆，在TA克隆应用上Taq DNA聚合酶仍然无法替代。

• Sanger测序
  

  Sanger测序又称第一代DNA测序，其特点是通过掺入ddNTP使DNA链终止延伸，产生不同断点的条带，经过凝胶电泳分析，即可确定四种碱基在DNA链中位置。1977年，Sanger先生使用该技术完成了一个五千多碱基对的DNA序列测定，开启了核酸测序的新时代。

  Sanger最早的测序酶是大肠杆菌pol I Klenow片段，效果并不太好，后来发现了来源于T7噬菌体的T7 DNA聚合酶，它掺入ddNTPs的能力比pol I和Taq优秀的多，通过氨基酸删除降低其3’-5’外切活性，具有极高的持续合成能力，是一个优秀的测序酶（Tabor, 1987; Tabor, 1995）。但是T7 DNA聚合酶是一个常温酶，不适合耐热型PCR，特异性不好。研究人员自然想到了耐热的Taq DNA聚合酶，然而野生Taq酶在Sanger测序中的表现并不理想，主要有两个问题：1.野生型Taq掺入ddNTP的活性很低，无法产生足够强度的测序谱带。2.掺入ddNTP的速率不均匀，Taq野生酶及突变体极显著的偏好ddGTP掺入。

  第一个问题率先被Reeve等（Reeve, 1995）解决，他们发现位于O-α螺旋（该结构处于活性口袋区，一般活性口袋的苯环结构都是值得关注的残基）中的F667对ddNTP掺入十分重要，F667Y显著提高了酶的ddNTP掺入能力。后来，Vander等（Vander, 1997）将Klentaq(F667Y)突变体与一种耐热型无机焦磷酸酶配合，测序性能更加优秀。不知道Life公司大名鼎鼎的BigDye是不是在此基础上研发的，BigDye中的ddNTP是被不同的荧光染料标记的，比ddNTP具有更大的空间位阻，可能需要更多的突变。第二个问题，1998年被Li等（Li, 1998; Li, 1999）解决，为了调查掺入ddGTP偏好的原因，他们结晶了Klentaq1-DNA-ddNTP三元复合物。数据揭示了精氨酸残基660（R660）的胍基侧链与传入的ddGTP的鸟嘌呤碱基的O6/N7原子之间的选择性相互作用，用带负电荷的天冬氨酸取代R660残基完全消除了ddGTP掺入的偏好，R660D/F667Y双突变体大大提高了染料终止法的测序质量和准确性。

  

  图 Vander Horn P B, 1997

  大肠杆菌pol I是第一代Sanger测序酶，存在较多缺陷，因此很快被取代；T7 DNA聚合酶是第二代，测序表现比较优秀，也曾闪亮一时；Taq DNA聚合酶是第三代，因其热稳定性成为最有潜力的测序酶，经过不断的改造和进化，Taq已经成为成熟的商业化测序酶，并长期“霸占”Sanger测序领域。

• 二代测序
  

  二代测序又称下一代测序（NGS），是近十几年迅速发展起来的一种测序技术，2014年开始风靡中国，势头很猛，大有取代Sanger测序的趋势，但Sanger测序仍发挥着不可替代的作用。NGS取得了巨大成功，就像illumina公司的Chen Cheng-Yao（Chen, 2014）说的，NGS技术彻底改变了现代生物学和生物医学研究，负责这项创新的引擎就是DNA聚合酶。DNA聚合酶在NGS技术中的应用包括两个方面：1、作为测序酶，2、作为建库试剂。

  （Guo J, 2010）在SBS方法中，使用固定化的DNA模板构建芯片，该模板能够自引发聚合酶反应。设计了四个核苷酸类似物，使得每个核苷酸类似物在碱基的特定位置上都标记有独特的荧光染料，并具有一个小的化学基团（R）来封端3'-OH基团。加入四个核苷酸类似物和DNA聚合酶后，聚合酶仅将与模板上下一个核苷酸互补的核苷酸类似物掺入芯片的每个斑点上（步骤1）。去除多余的试剂并洗掉所有未结合的核苷酸类似物后，使用四色荧光成像仪对芯片表面进行成像，并在芯片的每个点上从核苷酸类似物上的特定染料发出独特的荧光发射将产生核苷酸的身份（步骤2）。成像后，自引发模板部分上的少量未反应的3'-OH基团将被过量的3'-O-修饰的核苷酸可逆终止子和DNA聚合酶封闭，以避免干扰下一轮合成（步骤3）。染料部分和R保护基将被去除，以高产率产生游离的3'-OH基（步骤4）。通过重复步骤1、2、3和4以鉴定模板DNA的下一个核苷酸序列，在此阶段，芯片上的自引发DNA部分准备用于下一个反应周期。

  NGS技术的特点是边合成边测序（SBS），它使用一种可逆的的染料终止剂（脱氧核糖的3'-OH位置与荧光团之间，包含可裂解的化学基团，荧光信号被采集后通过化学方法去除荧光基团，新暴露的3'-OH能够继续聚合碱基），在测序过程中可以被清除，不会终止延伸反应。Klentaq(R660D/F667Y)突变体对这种染料活性不高，所以适用于Sanger测序的Taq酶并不适合NGS。NGS早期采用的是 9oN polymerase(exo-) A485L/Y409V突变体。不过，科研人员并没有放弃Taq DNA聚合酶，2010年，Leconte等人通过定向进化得到一个突变体Taq 197，掺入可逆性标记脱氧核糖核苷酸的能力比Klentaq突变体显著提高。Chen等（Chen F, 2010）通过定向进化得到一个突变体，掺入dNTP-ONH2能力显著提高。遗憾的是Taq DNA聚合酶最终并没有被广泛用于NGS。

  文库构建是NGS技术中最重要的步骤，而构建文库最重要的酶就是DNA聚合酶。建库要求酶具有极高的均一性和扩增效率，能够扩增高GC、高AT等复杂模板，WGS/WES、变异检测等对保真性也有较高要求。在这个方面，Taq DNA聚合酶依然没有Vent、Pfu、KOD等保真酶应用广泛。在特殊的测序领域，如甲基化测序，DNA经过重亚硫酸盐在高温、酸性条件下转化后会产生dC-dU碱基变换和碱基损伤，保真酶难以扩增，Taq DNA聚合酶成了不错的选择。2015年，Millar等人通过定向进化得到一个突变体5D4，能够绕过重亚硫酸盐处理DNA的dU碱基和损伤碱基。当然Pfu(exo-)等通过定向进化在这方面也取得了成功，因此对于NGS技术，Taq DNA聚合酶的应用并不普遍。至于第三代新型测序技术，主要以φ29 DNA聚合酶为主导，Taq DNA聚合酶在新兴测序领域似乎渐渐没落了。

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