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热敏UDG酶的作用原理

PCR张

2022-07-06

热敏UDG酶的来源

热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白，又称南极热敏UDG。该UDG酶能有效地水解单链或双链 DNA 上的尿嘧啶，产生的缺嘧啶位点，在高温或高 pH 下，极易水解断裂。该酶对RNA无活性，主要用于PCR扩增产物的防污染。大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解。

而来源于嗜冷海洋细菌的热敏型UDG在50℃ 5min即完全失活，在进行PCR扩增前，在PCR混合液中添加尿嘧啶-DNA 糖基化酶（热敏性），25℃10min即可消除PCR产物的残留污染，由于尿嘧啶-DNA 糖基化酶（热敏性）在PCR循环的94℃变性一步便可被灭活，因此不会影响新的含dU的PCR产物。

防污染UDG酶的作用原理

大肠杆菌热敏尿嘧啶DNA糖基化酶( UDG 也有些文章简写为UNG，UDG与UNG有一些差别 ) 是PCR防污染应用最广泛的酶之一，由UNG基因编码；该基因位于染色体5 分钟处，全基因长750bP，含有一个ORF，其长度为678b p，编码229 个氨基酸，理论蛋白质分子量为25，66 4Da；PCR 防污染正是利用了UDG在DNA 修复过程中的生物学特性，下面是UDG 作用于含尿啥吮的DNA ( U-DNA ) 的化学图解(图1) 和PCR防污染的示意图(图2)：

图1.

由图1可以看出，在适宜的条件下，UDG酶能特异地识别DNA分子中出现的鸟嘧啶核苷，并将其切割下来，形成自由的尿嘧啶，在DNA除去尿嘧啶的部位留下“糖一磷酸骨架” 完整的无碱基“空洞”，即脱嘌呤嘧啶位点，在加热或碱性条件下，DNA 在“ 糖一磷酸骨架”处断裂，这就是UDG 水解含尿唠吮DNA 的化学原理。

Magigen UDG酶防污染原理

为保证PCR结果的准确性，要预防非特异性PCR扩增和污染。常用的措施是使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase，尿嘧啶-N- 糖基化酶)+dUTP的防污染热启动PCR试剂盒（试剂盒以dUTP代替dTTP，所以PCR产物都是含有dU的“DNA”链）。

在PCR开始前，有一步保温步骤，此时UNG酶可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解（在非PCR条件下，比如在混PCR体系的时候产生的一些非特异扩增），消除由于污染DNA产生的扩增，同时UNG酶被灭活，不会再降解目的产物U-DNA。

dUTP不妨碍Taq合成“DNA” 双链，此时的“DNA”不是严格意义的DNA，是无法做克隆的，但是可以做荧光定量（因为可以嵌入SYBR Green）。

图2. Magigen UDG防污染原理图

在图2中，首先可以看到，由正常碱基A、T、G、C 构成的正常DNA，可以通过PCR反应，用dUTP代替传统的dTTP, 扩增出大量含有尿嚓吮的DNA ( U-DNA )，是热敏尿嘧啶-DNA糖基化酶的有效底物；当扩增产物作为残留污染物时，它能通过UDG酶的水解作用，产生脱嘧啶嘌呤位点，该位点当进行PCR预变性时，DNA 链在这些位点发生断裂，失去模板的功能，同时，通过预变性能够将反应体系中的UDG灭活，一方面有效的防止了残留污染物对PCR反应带来的污染，达到预防污染的目的，另一方面又有效地保护了新生扩增产物，完成新的PCR扩增。

Magien UDG酶的应用

UDG酶在PCR试验过程的防污染应用

热敏型UDG酶可用于去除单链或双链DNA中的尿嘧啶碱基，也可以去除PCR过程残存的污染。在PCR操作过程中，最容易出现污染问题，原因主要有如下几种情况：

1. 模板的交叉污染：在样品采集或处理中，气溶胶、加样器取样时的泡沫,或其他原因引起样品或模板的交叉污染，会造成假阳性，属于正常DNA由A、T、G、C 四种碱基组成引起的污染；

2. 扩增产物的污染：在PCR扩增过程中，将碱基T 置换成U，使得扩增产物为U-DNA (由A、U、G、C四种碱基组成)，由于产物量特别大，容易溢漏，引起污染，造成假阳性；

3. 核酸酶、蛋白酶的污染造成假阴性；

在这三种情况中最为严重是第二种，即称之为残留污染，因为PCR 扩增的放大倍数可以高达千万倍，而且在实际应用中，扩增一直在反复进行，会造成扩增产物的大量堆积，难于将其控制降解，即使是荧光PCR也很难避免扩增产物的污染。为了使得PCR结果更加可靠、准确，有必要在反应管完全封闭后，于管内通过酶或其他方法，将操作过程中可能带人的残留污染物破坏清除，使其不能成为新一轮扩增的模板，从UDG酶的生物学性质可知，它是完成这一任务的最佳选择。

从生物学特性来看，UDG酶是一种常见的DNA修复酶之一，具有DNA糖苷酶的一般特性，包括不依赖镁离子、球蛋白、分子量小，能够特异地作用于DNA分子中的尿嘧啶残基，不能作用于游离的尿嘧啶核苷、RNA 和四种正常的核苷酸等，在DNA 修复中起重要作用。