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用BiFC和triFC技术验证FTD相关蛋白的相互作用

Paolo Paganetti

2017-11-10

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在生理和病理条件下，蛋白质多聚是与神经退行性变有关的蛋白质的一个内在特征。

Mendelian形式的神经退行性疾病中的蛋白质突变、异常翻译后修饰和致病构象，都有助于蛋白质包涵体的累积。

这些蛋白质组合引发一系列的不良事件，最终导致神经元功能障碍、突触丧失、细胞死亡和脑功能恶化。朊病毒的进程，即累积蛋白沉积、蛋白毒性和致病蛋白形式的跨细胞扩散，是大多数神经变性疾病的典型表现，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）、额颞叶痴呆（FTD）和肌萎缩侧索硬化（ALS）。

预防蛋白质毒性进入成年期、或之后在疾病期间操控蛋白质毒性的分子事件仅部分被理解。

一些与神经退行性变相关的蛋白质呈现生理多聚体构象（例如SOD1、α-突触核蛋白、TDP-43），它们的离解可能导致功能丧失，或可能代表组装成毒性物种的先决条件。

为了了解导致神经退行性变的分子机制，研究蛋白质如何、何时和何地（自我）相互作用，以完成特定功能、将第一个组件构建成有毒物种至关重要。

最近的证据表明，与额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化相关的RNA结合蛋白TDP-43以生理和功能性核低聚物形式存在，其失稳可能是错误折叠、毒性和随后病理沉积的先决条件。

我们用两种分离绿色荧光蛋白的GFP技术并行实现了，在TDP-43自组装的情况下，GFP双分子biFC和三分子triFC荧光互补。

荧光"传感器"被用来确定细胞中蛋白质的相互作用。一个突出的例子是对多肽片段的补充，当接近时，这些片段能恢复酶的活性或荧光，例如绿色荧光蛋白GFP的重组。

双分子GFP荧光互补（bifc）需要结合两个非荧光片段，然后重组荧光团。

由于两个片段在典型的GFP β桶状结构构象中的组装几乎是不可逆的，甚至是弱的或短暂的蛋白质相互作用，biFC也可以形成、积累和检测。

此外，使用一个大的“传感器”片段（GFP_1-10）和一个由单个β链组成的小GFP片段（s₁₁蛋白标记）可降低s₁₁标记蛋白相关的生物学干扰的风险。

与直接融合相对较大的荧光蛋白相比，这是bifc蛋白技术的一个优势。

此外，这种方法显示出很高的灵活性，因为使用小标签提供了一种简单的技术策略，允许直接比较不同蛋白质或同一蛋白质的多个变体，特异性检测亚细胞蛋白池，并重组成具有不同发射特性的荧光蛋白。

新开发的三分子荧光互补（triFC）技术进一步发展了这一技术。

两个连续的单β链（T₁₀和T₁₁）被用于标记两个结合伙伴中的一个。蛋白质结合将两条β链定向，这样伴随第三个片段（GFP_1-9传感器）的呈现，将在体外和活细胞中重建荧光。

BiFC和triFC都需要对不同的GFP片段的氨基酸序列进行优化，使得T₁₁序列有两个氨基酸替代，比S₁₁序列稍长。BiFC另一个优点是低背景荧光。

用这两种技术对在神经退行性疾病中起关键作用的蛋白质组合的分子特性进行研究是合适的。

作为模型蛋白，我们选择了与微管相关的Tau和TAR-DNA结合蛋白43（TDP-43），这两种蛋白独立参与蛋白质折叠错误的疾病，如AD、PD、ALS和FTD。

大多数Tau阴性FTD病例显现了由泛素化和磷酸化TDP-43引起的神经元变化，TDP-43是一种在转录、RNA稳定性和剪接中起作用的核蛋白。

超过40个TDP-43突变与FTD/ALS疾病谱相关。对于这两种蛋白质，我们首先展示了它们在活细胞中的亚细胞定位和自相互作用。

在疾病进展过程中，TDP-43在功能失调的神经元和胶质细胞的病理包涵体中积累。因此，研究蛋白质与蛋白质的相互作用对于了解细胞在健康和疾病中的功能至关重要。

bifc和trifc的并行实现允许对蛋白质复合物进行广泛的表征。将triFC与免疫分析和流式细胞术相结合，可以对细胞中的这种相互作用进行有力的定量测量。

此外，对于triFC和BiFC的T₁₁标签的灵活利用, 允许将triFC数据的比例标准化，其蛋白表达水平由BiFC确定。

最重要的是，trifc不仅用于确定蛋白质自组装，更具体地说，在分子水平，用于确定蛋白质结构域与其相互作用决定因素的结合。

实验结果表明：

GFP-biFC能有效地定位细胞中的蛋白质。

GFP-biFC技术需要将优化的GFP拆分成两个大小相当不同的片段.

在N端或C端-用s₁₁标记（图1）。

图1. bifc显示Tau的细胞定位.

s₁₁-Tau和Tau-s₁₁首先在小鼠多功能神经祖细胞系c17.2细胞中,通过质粒转染分别表达。

GFP-triFC显示细胞中特定的多聚体蛋白组合。

图2. triFC显示TDP-43多聚体的细胞定位

细胞蛋白-蛋白质相互作用进行生化验证。

使用bifc/triFC可以对细胞蛋白-蛋白相互作用进行定量。

用triFC可以验证蛋白质组件内的分子间界面。

这些技术与基于正交读数的各种分析相结合，使我们能够定性和定量地定义TDP-43齐聚的结构决定因素。我们强调了GFP-bifc和trifc技术在研究神经退行性变背景下蛋白质多聚体的定位和机制方面的多功能性。

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参考文献

Split GFP technologies to structurally characterize and quantify functional biomolecular interactions of FTD-related proteins

Chiara Foglieni, Stéphanie Papin, Agnese Salvadè, Tariq Afroz, Sandra Pinton, Giona Pedrioli, Giorgio Ulrich, Magdalini Polymenidou & Paolo Paganetti