微生物群、生殖道炎症和肿瘤对阴道微环境中免疫检查点蛋白的影响
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宫颈癌是最常见的人乳头瘤病毒HPV相关癌症，也是全球女性中第四大常见癌症，2018年估计有570000例新病例和311000例死亡。
在过去的几十年中，广泛使用筛查方法，如Papanicolaou检测（宫颈细胞学）和基于HPV的分子检测，使得许多高收入国家宫颈癌死亡人数急剧下降。
然而，在低收入国家，大多数女性被诊断患有晚期或转移性癌，与宫颈癌相关的死亡率高。
尽管在筛查和预防方面取得了进展，但宫颈癌各阶段的5年总生存率为68%，而晚期宫颈癌的5年总生存率仅为15%。
这迫切需要改善治疗效果，特别是对于晚期或复发性疾病。
近来，免疫检查点抑制剂已经成为治疗晚期实体瘤（包括宫颈癌）的有希望的策略。
然而，最近的I、II期临床试验结果显示，对抗PD-1或抗PD-L1疗法的总体反应较低，范围为12.5%至26%。
这些临床研究还表明，总体反应率与PD-L1表达、HPV状态或先前治疗的数量无关。
这些发现强调，仍然迫切需要用于患者对免疫疗法的反应性的预测性生物标志物。
近年来，人类肠道微生物组已成为对免疫疗法反应性的潜在调节剂。
实际上，临床和动物研究表明，特定的肠道微生物介导T细胞活化，并增加肿瘤部位的T细胞引发和积聚，这导致免疫检查点抑制剂的功效提高。
这些研究提供了免疫检查点蛋白和肠道微生物组之间双向关系的有力证据。
然而，宫颈肿瘤免疫检查点蛋白与阴道微生物组之间可能的关系尚未被研究。
大多数健康绝经前妇女的阴道微生物群以乳杆菌属（L. crispatus，L. gasseri，L. jensenii或L. iners）为主，它们保护宿主免受性传播感染，如HPV。
迄今为止，多项流行病学研究一致表明，在患有宫颈发育不良和癌症的女性中，乳酸杆菌优势减少和失调菌群落增加，其特征在于多种厌氧微生物的过度生长。
最近对现有数据的两项荟萃分析强烈支持阴道微生物群在HPV持续性和宫颈疾病进展中的作用。
我们之前的研究还阐明了HPV、宿主防御机制和宫颈癌发生过程中阴道微生物群之间的功能相互作用。
值得注意的是，我们证明了宫颈阴道灌洗CVL中的宿主因子，包括循环癌症生物标志物，取决于生殖器炎症和阴道微生物群的组成。
为了更好地理解宫颈肿瘤疾病的生物学机制，我们研究了在阴道微生物群和生殖器炎症的背景下，从宫颈癌女性收集的CVL中的免疫检查点蛋白质谱。
临床和人群统计信息
在这项横断面研究中，我们分析了从78名未绝经、未怀孕的Arizonan州妇女中收集的临床样本，即CVL和阴道拭子，这些妇女有或没有HPV感染和宫颈瘤形成。
女性被分配到以下五组：
健康的HPV阴性对照组（Ctrl HPV-；n=18），
HPV阳性对照（Ctrl HPV+=n=11），
低度上皮内病变（LSIL；n=12），
高度上皮内病变（HSIL；n=27）
新诊断的浸润性宫颈癌（ICC；n=10）。
分组基于活组织检查的组织学、细胞学（当组织学不可用时）和如前所述的HPV基因分型。
47%的女性是西班牙裔，53%的女性是非西班牙裔。68%的女性超重或肥胖[体重指数（BMI>>25），各组平均年龄为38±8岁。
然而，在西班牙裔（P=0.15），BMI（P=0.97）和年龄（P=0.46）方面，各组之间没有显着差异。
宫颈阴道灌洗液中的局部免疫检查点蛋白
为了研究局部宫颈阴道微环境中的免疫检查点蛋白质谱，我们测量了从宫颈癌女性收集的CVL样品中16种免疫检查点蛋白的水平。
我们能够检测到所有蛋白靶标。
主成分分析PCA是一种数据缩减方法，用于说明各组之间的全面免疫检查点概况（图1）。我们利用了前两个主成分（PC1和PC2），它们解释了数据方差的70.4%。
图1. 宫颈癌患者表现出明显的局部免疫检查点特征。
该分析表明，可以在局部宫颈阴道微环境中检测到免疫检查点蛋白，并且与健康的HPV阴性女性、HPV阳性女性和患有癌前发育不良的女性相比，ICC患者表现出明显的免疫检查点特征。
免疫检查点蛋白和浸润性宫颈癌
当我们比较各组CVL样本中测量的免疫检查点蛋白水平时，我们发现ICC女性中16个目标中有6个与Ctrl HPV-组和和其他癌前组相比显着升高。
分析表明，特异性免疫检查点蛋白在ICC女性中显着且特异性地升高。
宫颈阴道免疫检查点-蛋白质相关网络
为了鉴定免疫检查点蛋白中潜在的生物网络，我们使用所有患者中免疫检查点的水平计算相关矩阵。
数据表明免疫检查点蛋白的产生和/或分泌是共同依赖的，并且这些分子形成涉及免疫抑制和免疫共刺激途径的复杂生物网络。
免疫检查点蛋白质，炎症和微生物群
以前我们证明宫颈瘤形成的严重程度与生殖器炎症和阴道微生物群组成有关，在此我们扩展了这些发现，并研究了免疫检查点蛋白水平，生殖器炎症评分和乳酸杆菌丰度之间的关系。
分析表明，几种免疫检查点蛋白（CD28，CD40，HVEM，PD-1，PD-L1，TIM-3和TLR2）与相关生殖器炎症显著正相关。
其中两种免疫检查点蛋白也与乳酸杆菌丰度相关：PD-L1呈负相关，TLR2呈正相关。
然而，LAG-3与乳杆菌丰度呈负相关，但与生殖器炎症无显着相关性。
为了更好地理解与癌症无关，我们还通过排除ICC样本进行了相关性分析。
这些分析揭示了几种免疫检查点蛋白的局部水平与阴道微生物群组成和生殖器炎症之间的关联，其与癌症无关。
免疫系统在控制HPV感染中起着至关重要的作用，但病毒可以逃避免疫监视。因此，HPV感染的宿主细胞与局部免疫微环境之间的相互作用决定了宫颈癌发生过程中肿瘤疾病的进程。
人类微生物组可以调节这种环境中的免疫应答，包括抗肿瘤免疫的关键组分，从而有助于免疫检查点抑制剂的治疗活性。
然而，宫颈癌发生过程中局部阴道微生物组与免疫微环境之间的串扰尚不清楚。
在这项研究中，我们检查了患有和没患有宫颈肿瘤的女性局部宫颈阴道微环境中的广泛免疫检查点蛋白，并探讨了这些关键免疫调节蛋白，阴道微生物群组成和生殖器炎症之间的关系。
我们已经证明可以在CVL中测量免疫检查点蛋白，这表明这些蛋白在宫颈阴道微环境中存在可溶形式。
与活组织检查相比，CVL的收集是一种微创，低成本且相对容易执行的程序。
在我们的研究中，与健康女性或癌前发育不良的女性相比，四种免疫抑制检查点分子（PD-1，HVEM，LAG-3和TIM-3）和两种免疫共刺激检查点分子（CD27和CD40）从宫颈癌患者收集的CVL中显着升高。
CVL中检测到的蛋白有很大的潜力可用于监测对治疗的反应，以及用作宫颈癌和其他妇科疾病妇女的预测或预后生物标志物。
生物标志物发现分析显示，与健康对照和发育不良相比，三种免疫检查点分子，特别是CD40，CD27和TIM-3，对宫颈癌表现出优异或良好的鉴别特性。
TIM-3和其他免疫检查点分子的CVL水平对宫颈癌患者的预后价值值得进一步研究。
之前，我们发现宫颈癌发生过程中阴道微生物群组成的变化与生殖器炎症、增殖改变和细胞凋亡、血管生成、激素失衡和代谢失调的证据有关，这些都是癌症的标志。
在本研究中，我们扩展了这些发现，并阐明了分泌的免疫检查点分子，它们是参与癌症免疫逃避的关键免疫调节蛋白，也与生殖器炎症水平和阴道微生物群组成有关。
我们观察到免疫检查点分子之间的复杂网络，因为它们中的许多与其他免疫检查点蛋白相关。这可以反映先前的观察结果，即这些蛋白质经常在多种细胞类型上共表达，包括T细胞、抗原呈递细胞和/或恶性细胞。
我们还观察到几种免疫检查点蛋白与生殖器炎症正相关，与其他组相比，癌症患者的生殖器炎症高度升高。为了减弱癌症对这些关系的影响，我们从随后的分析中排除了癌症样本。我们仍然观察到两种免疫共刺激分子CD40和CD28与HPV感染，宫颈发育不良和健康对照患者的生殖器炎症水平显着相关。
我们还揭示了特定免疫检查点分子与阴道微生物群组成之间的关系。我们鉴定了两种蛋白质，即PD-L1和LAG-3，与乳酸杆菌耗尽的失调微生物群相关。
PD-1已被证明会影响IgA的产生，从而影响肠道中的微生物群组成。
我们还发现TLR2与乳酸杆菌优势密切相关，但也与生殖器炎症升高有关。
图7. 宫颈阴道微环境中复杂的宿主-微生物网络。
总之，我们确定了与宫颈癌发生相关的免疫检查点特征，并阐明了局部微环境中的多方面微生物-宿主免疫网络（图7）。CD40，HVEM，PD-1和TIM-3水平升高将宫颈癌与生殖器炎症联系起来，而LAG-3将癌与失调的微生物群联系起来，TLR2桥接生殖器炎症和乳酸杆菌优势。所测试的免疫检查点蛋白中没有一个与癌症、炎症和微生物群的所有特征相关；然而，多个免疫检查点蛋白彼此相关，将所有特征联系在一起，这突出了宫颈癌发生过程中宿主，HPV和微生物群之间复杂的相互作用。
参考文献
Vaginal microbiota, genital inflammation, and neoplasia impact immune checkpoint protein profiles in the cervicovaginal microenvironment
Paweł Łaniewski, Haiyan Cui, Denise J. Roe, Dana M. Chase & Melissa M. Herbst-Kralovetz
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