利用synNotch-CAR-T细胞回路，提高CAR-T细胞的治疗效果
在Hernandez-Lopez等人最近在《科学》杂志上发表的一篇文章中，利用设计的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞），通过两步识别系统成功区分了高水平表达和低水平表达目标抗原的目标细胞，从而实现了对实体瘤异种移植的特异性排斥。
CAR-T细胞癌症疗法已被批准作为B细胞淋巴瘤的一种治疗方法。
在这些血液病中，正常B细胞的间接耗竭是一种可接受的风险，这些正常的B细胞表达与CAR-T疗法靶向相同的CD19抗原。
由于多种因素，包括肿瘤异质性、免疫抑制微环境，以及缺乏CAR-T细胞在保护健康组织的同时又能够识别的独特肿瘤靶点，实体肿瘤CAR-T细胞免疫治疗的进展一直困难。
组织特异性过表达的抗原如HER-2是有吸引力的肿瘤靶标，因为它们在患者和适应症中普遍存在，并且之前通过其他治疗方式验证。
然而，在用第二代HER-2靶向CAR-T细胞治疗的第一位患者中，HER-2特异性CAR-T细胞免疫疗法受到肺毒性发展的阻碍。
人们推测这种毒性是由肺上皮细胞上表达的低水平HER-2引发的。
CAR-T细胞免疫疗法可以通过基因工程的方法，将着靶/脱靶肿瘤毒性的损害（或附近健康组织的损伤）降至最低，以减轻危及生命的毒性，并在实体肿瘤中取得成功。
Hernandez-Lopez等人利用了一种称为“两步识别细胞电路”的精妙新方法。开发了一种由synNotch控制的基因表达系统。
在该系统中，低亲和力HER-2特异性CAR识别肿瘤细胞上高水平表达、而不是低水平表达的HER-2，诱导T细胞表面高亲和力HER-2特异性第二代CAR的表达（图1）。
在确认该系统在识别高表达HER-2、而非低表达HER-2的肿瘤细胞方面的有效性后，他们使用了多对进行了对侧注射、具有高水平和低水平HER-2表达肿瘤的异种移植小鼠模型，以证明表达该回路的CAR-T细胞转移后对HER-2高肿瘤的特异性排斥反应。
图1 CAR-T细胞利用两步识别细胞回路机制特异性识别并杀死表达高水平HER-2的癌细胞。 (From Jehad Charo)
在步骤1中，HER-2（棕色）高水平癌细胞被CAR-T细胞上的低亲和力CAR（橙色）识别，这导致步骤2中所示的融合转录因子的切割。
该转录因子启动高亲和力CAR（紫色）的转录和表达。HER-2高水平癌细胞被高亲和力CAR识别，激活CAR-T细胞，最终杀死HER-2高癌细胞。
开发这种方法的一个关键点是，一旦CAR-T细胞被高密度肿瘤细胞激活，低密度与高抗原表达细胞进行密度区分，以留出低密度正常细胞以备用。
作者已经证明，携带两步识别电路的CAR-T细胞能够有效地杀死HER-2高水平肿瘤细胞的球状体，在近端HER-2-low球状体上保持一定的杀伤活性，
但在较远的HER-2-low细胞上丧失了这种杀伤活性。这一特征是有益的，因为它能够杀死肿瘤微环境中靶抗原表达较低的肿瘤变体，同时保留更多具有低水平相同靶抗原的远端细胞。
Hernandez-Lopez等人利用了4D5-8或曲妥珠单抗序列，这是乳腺癌和胃癌的既定治疗方法。
曲妥珠单抗可特异性识别人类HER-2，但不能识别其小鼠直系血型ERBB2，因此无法评估两步识别电路是否能在小鼠模型中保留表达ERBB2生理水平的正常细胞。
这种评估可以使用ERBB2交叉反应CAR，或在精心计划的临床研究中进行。
Hernandez-Lopez等人还证明，这些CAR-T细胞优先（但不独占）在具有高HER-2表达的肿瘤中积累。
作者没有评论这种积累的动态情况或这些细胞是否具有活化表型，这两者都可以提示潜在的长期安全性.
两步识别系统可以简单地重复利用极低和高亲和力的CAR，如体外用第二靶抗原（EGFR）证实的，无需评估和鉴定每个新靶标的最佳CAR亲和力。
与正常组织相比，肿瘤上靶基因表达的时间性质和动态范围会限制synNotch-CAR-T系统在靶向相同抗原时的成功努力。
synNotch-CAR-T系统可用于构建具有双重目标识别能力的CAR-T细胞，从而进一步细化CAR-T细胞的特异性。随后的两篇文章对此进行了探讨。
这些文章证明，当与靶向肿瘤相关的过表达或组织特异性抗原结合时，synNotch-CAR-T可以排斥异种移植，异种移植可能携带肿瘤特异性靶抗原表皮生长因子受体剪接变异体III（EGFRvIII），或碱性磷酸酶胎盘类2（ALPPL2），包括ephrin A型受体2（EphA2），白介素13受体α2（IL13Rα2），黑素瘤细胞粘附分子（MCAM），间皮素，HER-2或髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG）。
这些研究表明，与组成型CAR-T系统相比，使用synNotch-CAR T具有显著的附加效益，即synNotch-CAR-T的持久性增加。
这至少部分归因于表达转录因子T细胞因子1（TCF1）的干细胞记忆型T细胞的优先表达，和衰竭标记物CD39的低表达，可能是由于高亲和力CAR的暂时表达。
为了验证这种和其他CAR-T细胞作为治疗实体瘤的方法，还有其他问题有待探讨。
然而，两步识别电路系统是对癌症免疫学工具的巧妙补充，可以进一步利用该系统，通过诱导抗原特异性CAR之外的特定效应分子或细胞因子表达，来驱动更强烈的免疫反应，从而提高该疗法的活性和持久性。
synNotch受体结构图
A. synNotch受体系统的概念设计图。 (From Leonardo Morsut)
左图：野生型Notch有一个大的胞外结构域，该结构域与其配体Delta结合，Delta在相对的配偶体细胞上表达，野生型Notch还有一个通过配体诱导的切割释放的细胞内转录调节结构域。
箭头表示多个蛋白水解切割位点。
中间：已构建Notch报告器，其中细胞内结构域被正交转录因子取代。
右图：在synNotch受体中，细胞外和细胞内结构域都被完全替换，只剩下Notch的小中央调节区。新的输入和输出都可以使用synNotch架构来定义
B. synNotch平台模块：Notch的输入和输出域可以与不同的域交换。在细胞外一侧，可以使用不同的识别域（显示基于抗体或肽标签），在细胞内一侧，可以使用不同的效应器（显示具有不同DNA结合域的转录激活子以及转录阻遏子）。
参考文献
T cell circuits that sense antigen density with an ultrasensitive threshold
Rogelio A. Hernandez-Lopez et al.
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