史上最全！CRISPR/Cas9基因编辑方法总结（一）
CRISPR Cas9基因编辑是目前流行的基因编辑技术。但是如何把CRISPR Cas9基因编辑方法讲清楚，却不是那么容易的事情。北京理工大学生命学院黄潮勇博士对CRISPR Cas9基因编辑技术进行了深入的研究。今天美格君邀请了黄潮勇博士，就CRISPR Cas9基因编辑技术为大家做一个全面、详细的介绍。大家也可以关注黄潮勇博士的个人微信公众号：[ My BioWorld ]，阅读其他相关文章、与黄潮勇博士交流。
CRISPR Cas9的来源及工作原理
CRISPR/Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统，存在于大多数细菌和古生菌中。原核生物在遭到病毒入侵后，能够把病毒DNA的一小段提取出来并存储到自身基因组上的特定区域， 我们把这个区域称为CRISPR存储空间。当再次遇到病毒入侵时，原核生物能够根据存储的DNA片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。根据CRISPR/Cas系统的特性，科学家将其改造成了目前最高效的基因组编辑工具。
目前应用最广泛的CRISPR/Cas系统是来源于酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes) 的CRISPR Cas9系统。2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier证明CRISPR Cas9系统可以在体外切割双链DNA [1]；2013年，张锋首次用CRISPR/Cas9系统在原核生物 (大肠杆菌) 中实现基因组编辑 [2]。
天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成：SpCas9 (以下简称Cas9)、crRNA、tracrRNA。其中，crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组成gRNA(guide RNA)，gRNA与Cas9蛋白结合后引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA序列 (图1)。为了方便实验设计以及提高gRNA的稳定性，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier将crRNA和tracrRNA融合成一条RNA [1]，并把其称为sgRNA (single-guide RNA) (图2)。
【图1】天然的CRISPR Cas9系统
【图2】改造后的CRISPR Cas9系统
改造后的CRISPR/Cas9系统成为研究者做基因编辑的首选工具。CRISPR Cas9蛋白要成功识别目标序列必须满足两个条件：(1) sgRNA的5'端20 nt和靶DNA之间碱基配对；(2) 靶DNA的3'端有合适的PAM序列。CRISPR/Cas9切割目标DNA后产生DSB (双链断裂)，DSB是一切基于核酸内切酶的基因编辑的基础，CRISPR/Cas9之所以颠覆了以往的基因编辑技术，就是因为只需要改变sgRNA的5'端序列即可重编程Cas9的序列特异性，设计和操作十分方便。
基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法
和其它基于核酸内切酶的基因编辑技术类似，基于CRISRP Cas9的基因编辑技术主要分为两个过程。首先，Cas9蛋白特异性切割目标DNA序列，产生DNA双链断裂；然后，细胞内的DNA修复系统修复双链断裂，在修复的过程中实现DNA序列的改变 (图3)。DNA修复机制分为两类：同源重组 (HR) 和非同源末端连接 (NHEJ)。同源重组修复需要借助修复模板，可以实现精确可控的编辑；NHEJ修复不依赖修复模板，直接将两个DNA末端拼接，但在拼接的过程中会产生碱基插入或缺失 (indels)，无法实现精确的编辑 。
正如图3所示，CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理很简单，但是科学家们却玩出了很多不同的花样。针对大肠杆菌，科学家们已经报道了很多基于CRISPR/Cas9的基因组编辑方法 (或protocol)，我会把其中具有代表性的方法介绍给大家，这次先介绍几种基于同源重组的方法。
方法一：CRISPR/Cas9介导的重组工程
重组工程是利用λ-Red系统介导线性DNA与基因组DNA重组，所用的线性DNA可以是ssDNA (单链DNA) 或dsDNA (双链DNA)，线性DNA作为编辑模板携带了所需引入的序列突变。当采用dsDNA作为模板时，可以携带一个抗生素抗性基因作为筛选标记，重组成功的细胞具有对相应抗生素的抗性。当采用ssDNA作为模板时，无法携带筛选标记，只能通过PCR的方式进行筛选。利用抗性基因筛选，事后还要消除抗性基因，同时会留下一段无关序列 (FRT或loxP)；利用PCR的方法，需要从大量的克隆中筛选，也比较费时费力。CRISPR Cas9可以作为筛选系统，解决重组工程筛选困难的问题。
在重组工程中，我们是将线性DNA (单链或双链) 电转到含有λ-Red重组酶的宿主细胞中，线性DNA一旦进入细胞便会在重组酶的驱动下参与同源重组，λ-Red重组酶是在制备感受态细胞的过程中诱导表达的。
在CRISPR/Cas9介导的重组工程中，我们需要将线性DNA和组成型表达sgRNA的质粒一起电转到含有λ-Red重组酶和Cas9蛋白的宿主细胞中 (图4)，λ-Red重组酶是在制备感受态细胞的过程中诱导表达的，Cas9蛋白是组成型表达的。λ-Red系统可以整合到Cas9质粒上进行表达，也可以整合到宿主基因组上进行表达。
一般大家认为同源重组先发生，Cas9蛋白切割DNA后发生，CRISPR Cas9蛋白只是作为筛选工具，杀死那些没有经历同源重组的细胞。实际上，Cas9蛋白切割DNA也可以比同源重组先发生；而且，DSB的产生会充分激活细胞的修复机制，提高同源重组的频率。研究者发现，在传统的重组工程中，以ssDNA和dsDNA为模板所得到的重组频率分别是10%和1.1E－4；而在引入了DSB之后，重组频率分别提高到100%和7.5% [3]。不过在这里必须强调的是，重组频率不等于编辑效率。
方法二：将编辑模板整合到质粒上
方法一延续了重组工程的做法，利用线性DNA (PCR产物或合成的寡核苷酸链) 作为编辑模板参与同源重组。我们知道，细胞内含有多种DNA核酸外切酶，当线性DNA进入细胞便会遭到这些酶的攻击，从而开始降解。只有那些在编辑模板降解之前发生重组反应的细胞才可能被编辑。由于线性DNA的降解是从两端的同源臂开始的，只要有其中一个同源臂降解了，重组反应也就不可能发生了。所以，为了提高重组频率，可以适当增加同源臂的长度；也有研究者对编辑模板的两端进行特殊的修饰，从而延缓编辑模板被降解的速率。
然而，线性的编辑模板终究还是不稳定的，要从根本上解决这个问题，就需要将编辑模板整合到质粒上。目前，大部分研究者采用双质粒基因组编辑系统，一个质粒用来表达Cas9蛋白和λ-Red重组酶，另一个质粒用来表达sgRNA，为了实验方便，编辑模板最好整合到sgRNA质粒上，如图5所示。
在上图所在的那篇文章里，研究者利用这个方法实现了3个基因组位点的同时编辑 [4]。将编辑模板整合到质粒上有三个作用。第一，编辑模板可以免受DNA核酸外切酶的攻击；第二，编辑模板可以随着质粒一起复制，从而增加拷贝数；第三，可以增加转化效率，因为转化一个sgRNA质粒的效率比共转一个sgRNA质粒和一个线性DNA的效率高得多。
将编辑模板整合到质粒上之后，编辑模板不能像在重组工程中那样直接与基因组重组，而必须等基因组被Cas9蛋白切断之后才能与之重组。在这里我解释一下原因：除非是存在特殊的重组位点 (比如loxP) 和作用于这个位点的重组酶 (比如Cre)，否则基因组与质粒之间不会发生重组；基因组与编辑模板两者之中至少要有一方是线性的，同源重组才能发生。所以基因组编辑的过程是：Cas9将所有细胞的基因组切断，这时所有细胞都面临死亡的危险，于是每个细胞都用尽全力对自身的基因组进行修复，有些细胞利用同源重组修复成功，脱离了死亡的危险，而那些在一定时间内没有完成修复的细胞则走向了死亡。
方法三：改进版的重组工程
重组工程的一个缺点是，编辑成功之后，需要通过位点特异性重组系统 (比如Flp/FRT) 来除去筛选标记 (抗性基因)，这个过程费时费力；而且，筛选标记去除之后，还会留下一段FRT序列，无法做到无缝编辑。但是，相比CRISPR/Cas9介导的方法，重组工程也有优点，那就是不需要构建sgRNA质粒。有一种方法能结合两者的优点，做到不需要构建sgRNA质粒，同时也能无缝地去除筛选标记。图6形象地展示了这个方法的原理。
【图6】改进版的重组工程 [5]
这个方法的创新之处在于编辑模板的设计。传统的重组工程所用到的编辑模板由两个同源臂、一个待插入基因 (做基因插入时需要) 和一个两端带有FRT序列的抗性基因组成；而新的方法所用到的编辑模板去掉了FRT序列，添加了一个人为设计的Cas9靶位点 (N20+PAM) 和一个短同源臂 (L-short)，这个短的同源臂与左同源臂 (L) 的一部分同源。
该方法分两步进行编辑，第一步与传统的重组工程相似，即把线性编辑模板转入目标菌株，由λ-Red介导同源重组。目标菌株中预先转入了一个质粒，用于表达λ-Red重组酶和Cas9-sgRNA，由两种不同的诱导型启动子 (Plac和PBAD) 控制。制备感受态细胞时诱导λ-Red重组酶表达，但不诱导Cas9表达。编辑模板自带的抗性基因在第一步编辑中作为筛选标记。第一步编辑成功后，取阳性克隆进行第二步编辑。进行第二部编辑时，同时诱导λ-Red重组酶和Cas9-sgRNA表达，Cas9蛋白切割第一步编辑时引入的靶位点，引发基因组内部同源重组 (L-short和L之间)。这一次重组的结果是筛选标记和靶位点被消除，获得无缝编辑产物。
这种方法的编辑效率取决于第一步编辑的效率，因为第二步编辑的效率远高于第一步。由于第一步编辑与传统的重组工程相同，所以从编辑效率上来讲，这种方法没有优势。这种方法的优势是便于去除筛选标记；此外，这种方法还能用于基因组大片段的敲除 (图7)。
【图7】基因组大片段的敲除
结束语：基于CRISPR Cas9的基因编辑方法实在太多，为了控制文章的篇幅不至于过长，今天就先写到这里吧。不过别担心，后续会继续介绍更多的方法，也包括我自己建立的方法，敬请期待哦~
参考文献
https://doi.org/10.1038/s41598-017-16998-8
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表1. 常用CRISPR/Cas9蛋白及其相关产品
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