抗生素抗性基因(ARGs)在不同生境的赋存和传播加剧了相应的耐药风险，其监测和控制依赖于检测方法。技术开发的难点在于如何兼顾灵敏、快速和便携，为了实现该目标，浙江大学胡宝兰课题组开发了基于重组酶聚合酶扩增(RPA)-CRISPR/Cas12a一步式反应碳青霉烯抗性基因blaNDM的检测方法。首次提出了耦合组分优化、次优PAM抑活和甘油辅助相分离多策略来提升一步式检测的灵敏度优化范式MOSAIC(Multi-strategy Optimized Sensitive Assay via Integrated CRISPR/Cas12a)。各策略对灵敏度的提升效果为甘油辅助相分离>次优PAM抑活>组分优化。协同效应使组合优化策略实现了4个数量级的灵敏度提升，优于单独优化策略。MOSAIC的检测限(LOD)达到了与qPCR相当的260拷贝/微升，且可在标准化96孔板上实现更加快速便捷(1小时，37℃)的定量检测。在临床细菌样品检测中达到100%的敏感性和95.45%的特异性；在环境基质加标样品检测中达到了77.41%–99.73%的准确性。研究为blaNDM现场快速检测提供技术储备，为不同靶标的RPA-CRISPR/Cas12a一步式检测方法开发提供新见解和优化范式。

摘要图

针对70种blaNDM变体构建了CRISPR/Cas12a检测体系。在邻近常规PAM(TTTV)和次优PAM(TTTN、ATTN、CCCA)的位置分别设计了3条和6条gRNAs。常规PAM组的gRNA-1产生最强的荧光，其CRISPR/Cas12a检测的LOD为10^6拷贝/微升(图1B和1C)。与已报道的CRISPR/Cas12a检测体系(针对不同靶标，10^5–10^8拷贝/微升)相符，表明gRNA-1能够介导blaNDM的高效检测。

设计并优选了gRNA对应的RPA引物，构建了RPA体系。gRNA-1所对应的7对引物中，F6-R4扩增效率最高，但相对于参照基因仍不理想(图1D)。若更换靶标区域，即选择次优PAM组的gRNA-5/6，可进一步提升扩增效率(图1E)。blaNDM的碱基排列和二级结构可能限制了引物的设计与结合，进一步导致了扩增效率低下。这种难扩增的特性表明开发其检测技术更具挑战。

图1 (A) RPA-CRISPR/Cas12a检测原理与技术难点；(B) 不同gRNA的活性比较；(C) CRISPR/Cas12a单独检测不同浓度blaNDM标准品的实时荧光曲线；(D) gRNA-1对应正向(上)和反向(下)引物的凝胶电泳条带图；(E) gRNA-5/6对应正向(上)和反向(下)引物的凝胶电泳条带图。

2. 通过组分优化识别了一步式检测的最佳反应条件

将RPA-CRISPR/Cas12a置于一个反应室内同时进行，为一步式检测。一步式检测通过RPA提升靶标浓度，使低浓度的blaNDM易于被CRISPR识别。其技术难点在于(1)RPA酶对荧光探针的非特异性裂解；(2)引物设计的局限性和Cas12a介导的引物裂解导致扩增效率低下；(3)CRISPR快速反应抢占了靶标，干扰RPA扩增子的积累；(4)对于难扩增基因，上述因素互相加剧了各自的负面影响(图1A)。这些不良竞争导致一步式检测的LOD劣于单独使用CRISPR。

通过各反应组分的优化有助于使RPA和CRISPR达到平衡，改善反应条件。首先探究了3种不同长度和二级结构的荧光探针的性能(图2A)。短链单链探针SP具有最低的背景荧光和最高的稳定性(图2B和2C)。进一步优化了关键组分的浓度，最佳值分别为：引物400 nM，SP探针500 nM，gRNA-1 20 nM，Cas12a蛋白20 nM(图2D–2F)。相较于原始体系，优化后的一步式检测缓解了两个体系的竞争，LOD达到与单独使用CRISPR/Cas12a相当的10^6拷贝/微升(图2G)。

图2 (A) 荧光探针结构示意；(B) RPA酶对LP探针的非特异性裂解；(C) 荧光探针的稳定性比较；(D) SP探针浓度优化；(E) gRNA:Cas12a配比优化；(F) gRNA-Cas12a复合物浓度优化；(G) 组分优化后的一步式检测LOD。

3. 组合策略的协同效应强化一步式检测灵敏度

为了进一步降低CRISPR对RPA的干扰，采用次优PAM策略抑制CRISPR反应的活性。将高效gRNA-1(对应常规PAM)更换为活性适中的gRNA-5(对应次优PAM)，搭配其最佳引物F13-R18，可将灵敏度强化1个数量级，LOD达10^5拷贝/微升(图3A和3B)。

甘油辅助相分离策略利用甘油的黏稠性降低RPA和CRISPR体系的混合速度以缓解两者的不良竞争。改进了现有方法，采用双侧加样的方式在标准化的96孔板中实施该策略，保证了高通量、低成本和普适性(图3C)。该策略可将灵敏度强化2个数量级，LOD达10^4拷贝/微升(图3D)。

组合策略将一步式检测的LOD降低至260拷贝/微升(图3E)。表明灵敏度提升了4个数量级，产生了超越单策略优化效果加和的协同效应。将该方法命名为MOSAIC(Multi-strategy Optimized Sensitive Assay via Integrated CRISPR/Cas12a)。相较于金标准qPCR(LOD 260拷贝/微升)，MOSAIC更加快速便捷(1小时，37℃)。相较于同类研究(LOD 10^6–10^8拷贝/微升)，MOSAIC更为灵敏。

图3 (A) 次优PAM抑活策略强化的LOD，使用gRNA-5与引物F19-R19；(B) 次优PAM抑活策略强化的LOD，使用gRNA-5与引物F13-R18；(C) 甘油辅助相分离策略的加样示意图；(D) 甘油辅助相分离策略强化的LOD，使用gRNA-1与引物F6-R4；(E) 组合策略强化的LOD，使用gRNA-5与引物F13-R18；(F) 两步式检测的LOD，使用gRNA-1与引物F6-R4。

4. MOSAIC具有高敏感性、特异性和准确性

为评估MOSAIC的诊断敏感性和特异性，用其定性检测临床细菌分离株中的blaNDM(图4A)。在40分钟的快速检测中，方法达到了100%(23/23)的敏感性和86.36%(19/22)的特异性，3株假阳性菌株仅显示出略高于判读线的信号。将检测时长延长至常规的1小时，特异性提升至95.45%(21/22)。MOSAIC定性检测的高敏感和高特异使其具备临床诊断应用的潜力。

为评估MOSAIC在环境分析中的应用潜力，用其定量检测加标地表水和污水中的blaNDM(图4B)。以加标值为基准，MOSAIC达到了77.41%–99.73%的准确性，而qPCR则为69.91%–99.79%。MOSAIC展现出与qPCR相当的高准确性。样品成分的复杂性对MOSAIC的环境应用是一大挑战。模拟水样分析表明，较为理想的检测条件为腐殖酸<20 mM、pH值6.5–8.5、Na+<50 mM且Ca2+<2.5 mM时。0.8–100 NTU的浊度对反应的信背比未产生显著抑制，较高的Fe3+浓度(62.5 μM)甚至略微促进了反应。

图4 (A) MOSAIC定性检测临床细菌样品，40分钟结果(左)与1小时结果(右)；(B) MOSAIC定量检测环境加标样品，地表水中的准确性(左)与污水中的准确性(右)。

以难以扩增的碳青霉烯类抗性基因blaNDM为例，提出多策略组合优化范式MOSAIC，为不同靶标提供灵活的模块化工具，可选择性地整合单一或组合策略，以满足成本、操作简易性和检测灵敏度等多样化需求。其LOD达到与qPCR相当的260拷贝/微升，且能在标准96孔板上，于37℃条件下一小时内完成检测。技术兼具速度、灵敏度、便捷性和准确性，综合性能超越qPCR。MOSAIC可为基因污染风险的及时预警提供技术支撑，应对临床环境中blaNDM菌株的流行与其在环境储存库中不断传播所带来的挑战。