自发现以来，规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/Cas系统凭借其简便性和高效性，推动了生物检测领域的变革性发展。基于Cas蛋白构建的信号传导系统已广泛应用于肿瘤早期筛查、病毒检测以及分子逻辑电路等领域。然而，由于Cas蛋白激活机制相对受限，CRISPR/Cas信号系统与多样化输入信号之间的兼容性受到限制，从而制约了其应用的广泛性和灵活性。

在本研究中，华中科技大学同济医学院附属同济医院潘老师团队开发了一种Cas12a与Cas13a协同靶向系统（Cas12a and Cas13a Integrated Targeting, CACIT）。该系统利用DNA/RNA链置换反应整合Cas12a和Cas13a的酶学功能，实现了对DNA和RNA输入信号的同时响应，兼具优异的可编程性和成本优势。通过引入链置换反应，CACIT系统能够实现Cas12a与Cas13a的同步激活，从而构建统一的信号传递平台。

我们进一步证明，CACIT系统在单核苷酸变异（SNV）检测、病毒RNA检测、基于机器学习的核酸浓度响应模型构建、分子逻辑运算以及细胞内成像等多个应用场景中均表现出卓越性能。作为一种简洁而通用的信号传导平台，CACIT系统拓展了CRISPR/Cas系统的激活策略和应用边界。凭借其良好的兼容性和简易性，该系统能够方便地与多种纳米器件集成。此外，CACIT系统还可作为分子网络中的高可编程、多功能计算模块，为人工信号系统的构建提供新的设计思路和实现途径。

Cas12a子系统机制验证

为了验证集成激活系统中Cas12a模块的可行性，并确保其能够兼容后续链置换过程且维持稳定的旁切活性，我们首先研究了单链DNA激活子是否能够通过链置换反应激活被单链RNA（ssRNA，记为TRNA）部分封存的12crRNA。其中，TRNA中与12crRNA互补的区域被定义为T1区，对应的12crRNA区域定义为C1区。实验中，我们首先将12crRNA与TRNA退火形成复合物，随后加入与12crRNA spacer区域完全互补的ssDNA激活子以及带有荧光基团（FAM）和淬灭基团（BHQ）标记的ssDNA报告分子。由于ssDNA激活子与12crRNA之间具有更长的互补配对长度，因此在与TRNA竞争结合12crRNA时具有热力学优势。当激活子通过链置换成功取代TRNA后，Cas12a被激活并产生旁切活性，从而切割ssDNA报告分子。报告分子被切割后，荧光基团与淬灭基团之间的距离增大，导致荧光共振能量转移（FRET）发生变化，从而产生可检测的荧光信号（图1A）。实验结果表明，在TRNA部分封存12crRNA的条件下，ssDNA激活子能够通过toehold介导的链置换反应有效激活Cas12a，尽管其激活速率低于直接激活方式（图1B）。随后，我们进一步研究了TRNA封存长度对Cas12a激活动力学的影响。在保持12crRNA spacer长度恒定为22 nt的条件下，设计了一系列具有不同T1区长度的TRNA，并使用相同的ssDNA激活子进行激活。结果显示，不同T1长度对应的激活动力学曲线（图1C、图1D）与T1长度呈显著负相关关系，即T1区越长，Cas12a激活速率越低。上述结果证明，Cas12a激活过程与链置换反应具有良好的兼容性，通过精确调节T1区长度以及双链互补区域长度，可实现对Cas12a激活动力学的精细控制。这为后续集成激活系统中信号强度的优化以及SNV检测灵敏度和特异性的提升奠定了坚实基础。

Cas13a子系统机制验证

我们验证了当13crRNA被单链DNA（记为TDNA）部分封存时，ssRNA激活子是否仍能够触发Cas13a活化。为此，我们设计TDNA与13crRNA spacer区域5'端部分互补，并将该互补区域定义为T2区。实验中，首先将13crRNA与TDNA预退火形成复合物，随后加入ssRNA激活子以及带有FAM和BHQ标记、且序列无关的ssRNA报告分子。若Cas13a成功激活，则其旁切活性将切割ssRNA报告分子，从而产生可检测的荧光信号（图1E）。实验结果验证了我们的假设，即Cas13a与Cas12a类似，也能够通过链置换反应实现激活（图1F）。随后，我们研究了TDNA互补长度对Cas13a链置换激活动力学的影响。通过将T2区长度从0 nt逐步增加至26 nt，获得了相应的荧光动力学曲线（图1G、图1H）。结果表明，链置换对Cas13a激活动力学的影响与Cas12a高度一致，Cas13a激活速率与T2区长度呈负相关关系。通过精确调节toehold长度、双链互补长度以及错配位置，我们实现了对Cas13a子系统激活强度跨多个数量级的调控。与传统Cas13a激活策略对单碱基错配具有较高容忍度不同，基于TMSD介导的激活方式显著提高了Cas13a对单核苷酸变异（SNV）的识别能力。此外，错配位置及TDNA中T2区长度的优化均可在不改变crRNA序列的前提下独立完成，因此具有优异的可预测性和通用性。这不仅简化了体系优化流程，也降低了开发成本，为构建Cas12a与Cas13a协同工作的集成激活系统提供了重要基础。

图1. Cas12a和Cas13a子系统工作原理的验证。(A) DNA激活子通过链置换反应取代封存（masking）12crRNA的TRNA，从而激活Cas12a的顺式切割（cis-cleavage）和旁切（trans-cleavage）活性。(B) 直接激活Cas12a与基于Cas12a子系统激活效率的比较。阴性对照组（N.C.）仅向反应体系中加入TRNA–12crRNA复合物。(C, D) 在不同T1区域长度条件下，TRNA封存状态的Cas12a子系统激活效率比较。(E) RNA激活子通过链置换反应取代封存13crRNA的TDNA，从而激活Cas13a的顺式切割和旁切活性。(F) 直接激活Cas13a与基于Cas13a子系统激活效率的比较。阴性对照组（N.C.）仅向反应体系中加入TDNA–13crRNA复合物。(G, H) 在不同T2区域长度条件下，TDNA封存状态的Cas13a子系统激活效率比较。

CACIT系统的构建与功能验证

在验证Cas12a和Cas13a子系统功能后，我们通过引入共享序列将两者整合，构建了CACIT系统。该系统的核心组分包括12crRNA、13crRNA、TDNA、TRNA、两种Cas蛋白、ssDNA报告分子以及ssRNA报告分子。与前文保持一致，用于封存（sequester）12crRNA的ssRNA被定义为TRNA，而用于封存13crRNA的ssDNA被定义为TDNA。我们在TRNA的5'端引入了与12crRNA互补的R1区域，并在TDNA的3'端引入了与13crRNA互补的R2区域。TRNA由5'端R1区域、中间T1区域以及3'端P1区域组成；TDNA则由5'端P2区域、中间T2区域以及3'端R2区域组成。其中，T1和T2区域具有相同的序列，仅TDNA中的胸腺嘧啶（T）在TRNA中被尿嘧啶（U）替代。通过精细的序列设计，我们实现了Cas12a与Cas13a子系统的无缝功能整合。共享序列模块在功能上将两种Cas蛋白的封存链和激活链耦联起来（图2A）。在没有额外靶标链存在的情况下，将预组装的12crRNA-TRNA复合物与13crRNA-TDNA复合物混合后，会启动一系列级联反应步骤。混合后，两个复合物依次发生基于toehold介导的链置换反应，最终形成活性的Cas12a-TDNA-12crRNA复合物和Cas13a-TRNA-13crRNA复合物，从而触发荧光信号释放。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析证实，在CACIT反应后TDNA和TRNA均发生了同步切割（图2B）。荧光动力学曲线显示，在CACIT系统中Cas12a与Cas13a协同激活产生的荧光强度显著高于单独激活任一酶时的信号水平（图2C）。通过使TDNA和TRNA同时能够作为输入信号，CACIT系统实现了对DNA和RNA输入的双重兼容。

CACIT集成激活系统的活性调控

CACIT系统的激活水平受toehold交换链置换反应吉布斯自由能变化（ΔG）的调控。TRNA和TDNA中的R1与R2区域被定义为调控区域（regulation regions），通过调节其长度，可以精确改变反应的吉布斯自由能变化，从而在一定范围内实现信号输出的精细调控。我们选择R区域作为主要调控区域，是因为调节R区域长度能够在最大程度保留反应启动能力的同时，实现精确的热力学调控。相比之下，P区域作为toehold区域，其长度变化会显著影响反应的启动效率和动力学过程，因此不利于独立调节体系热力学特性。实验结果表明，当R1长度大于4 nt或R2长度大于9 nt时，系统激活水平受到明显抑制；而当R1长度为3 nt时，无论R2长度如何变化，系统均能够产生稳定且较强的荧光信号（图2D）。此外，在T1和R1区域引入碱基错配后，体系的热力学调控能力进一步增强，表明CACIT系统具有多维度可调控的激活特性。与此同时，非相关核酸序列的存在不会影响CACIT系统及其各子系统的激活效率。与现有多数仅依赖多种酶简单共存的多重检测策略不同，CACIT平台的核心创新在于构建了一个统一的四链链置换反应网络。这一机制设计实现了同步、双向的激活回路，将Cas12a和Cas13a的活性耦合为一个协调一致的单一检测事件。凭借其高度可编程性和模块化设计，CACIT系统能够与多种核酸工具灵活集成。其可调控性、DNA/RNA双输入兼容性以及高灵敏度等核心优势，为后续的生物传感和分子诊断应用奠定了坚实基础。

图2 CACIT系统的构建与功能验证。(A) CACIT系统工作原理示意图。TRNA和TDNA分别封存12crRNA和13crRNA，使Cas12a和Cas13a处于失活状态；通过链迁移反应形成新的crRNA复合物后，分别激活Cas12a和Cas13a。(B) 采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证CACIT系统的可行性。(C) CACIT系统中Cas12a和Cas13a协同激活产生的信号与单独激活Cas12a或Cas13a产生信号的比较。(D) 通过调节R1和R2区域长度实现CACIT系统信号输出水平的精细调控。

在本研究中，我们开发了Cas12a和Cas13a集成靶向（Cas12a and Cas13a Integrated Targeting，CACIT）系统。这是一种利用DNA和RNA链置换反应构建的通用平台，能够兼容多种类型的激活信号，包括DNA、RNA以及蛋白质。通过引入四链链置换反应，CACIT系统能够同步激活Cas12a和Cas13a的切割活性，从而提出了一种全新的Cas蛋白激活策略。该链置换机制赋予系统优异的可调控性，使其能够实现对检测分辨率和单核苷酸变异（SNV）识别能力的精确调节，同时仅需调节TDNA和TRNA即可完成体系优化，无需重新设计crRNA。我们进一步构建了随机森林（Random Forest）模型，通过捕捉TRNA和TDNA浓度之间的相互作用，准确模拟CACIT系统的激活动力学行为。借助无需酶参与的链置换反应，CACIT系统能够无缝衔接上游逻辑运算输出，执行复杂的逻辑操作，并成功实现了APE1和miRNA-21的双靶标细胞内成像。我们将CACIT系统成功应用于SNV检测、病毒RNA检测、基于机器学习的浓度响应系统以及组合逻辑电路构建与细胞内成像等多个场景，不仅拓宽了CRISPR/Cas信号平台可兼容的输入类型和应用范围，也为Cas蛋白激活途径的调控建立了一种创新性范式。这些进展在临床诊断和分子计算领域展现出重要的应用前景。