从实验室到现场：用于早期短喙和侏儒综合征病毒核酸检测的创新RPA-CRISPR/Cas12a平台
短喙侏儒综合征病毒 (SBDSV) 是短喙侏儒综合征 (SBDS) 的病原体，该病以鸭喙萎缩和生长缓慢为特征。SBDS已给水禽养殖业造成了重大经济损失。为满足快速、准确诊断SBDSV的迫切需求，福建省农业科学院王劭团队开发了一种双模式检测平台，该平台将重组酶辅助扩增 (RPA) 与基于CRISPR/Cas12a的荧光检测及侧向层析试纸条 读数相结合。优化后的检测方法最低检测限达10拷贝/μL。该平台在区分SBDSV与遗传相关的番鸭源鹅细小病毒 (GPV) 和经典GPV方面表现出卓越的特异性，而这是实时荧光定量PCR (qPCR) 所无法实现的。使用36份田间样品进行的临床验证表明，其结果与qPCR和间接免疫荧光试验 (IFA) 完全一致，且与其他常见鸭病病原体无交叉反应。此创新性检测体系为SBDSV的现场化监测提供了一个强大的工具，并为开发适用于多种水禽相关病原体的新型诊断方法学奠定了坚实基础。该实验成果发表在《Poultry Science》，题目为“ From lab to field: Innovative RPA‒CRISPR/Cas12a platform for early short-beak and dwarfism syndrome virus nucleic acids detection”。
方法
首先从病毒株中提取核酸并构建标准质粒，设计靶向SBDSV VP3基因的RPA引物和特异性crRNA。通过优化RPA反应条件和CRISPR/Cas12a系统中Cas12a浓度、crRNA浓度和FQ-ssDNA探针浓度，建立了荧光和侧流层析条的双模式读取信号的检测体系。检测流程分为两步：第一步在37℃金属浴中进行10分钟的RPA等温扩增，直接使用组织裂解粗提核酸（无需纯化）；第二步将RPA扩增产物加入预组装的Cas12a-crRNA核糖核蛋白复合物中，激活Cas12a的反式切割活性。
检测结果通过双模式输出：
荧光模式：Cas12a切割FAM-淬灭剂标记的单链DNA报告探针，释放荧光信号，使用便携式蓝光透射仪肉眼观察绿色荧光；
侧向层析试纸条模式：Cas12a切割FAM-生物素双标记探针，通过试纸条上检测线（T线）和质控线（C线）的显色结果判读（双线阳性，单C线阴性）。
最后，将建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法用于36份临床样品检测。
图1 RPA-CRISPR/Cas12a平台用于诊断GPV流程图
结果
本研究成功构建了RPA-CRISPR/Cas12a双模式检测平台，可在50分钟内完成SBDSV核酸的10 copies/μL级灵敏检测。该方法用于36份临床样本检测，其荧光和侧向流可视化结果与qPCR及间接免疫荧光的判定结果一致，并能将SBDSV与序列高度相似的MDGPV和C-GPV精准区分而无交叉反应；同时证明无需DNA纯化即可用5分钟快速裂解的粗提物直接检测，显著简化现场操作流程。
图2 RPA–CRISPR/Cas12a检测系统的可行性分析
(A) 在470 nm蓝光照射下，五种反应体系的肉眼可视化结果。其中符号“+”和“−”分别表示对应组分在反应体系中的“存在”或“缺失”。(B) 五种反应体系的实时荧光分析。Cas12a、crRNA及FQ-ssDNA荧光探针的终浓度分别为100 nM、200 nM和300 nM。以含有SBDSV病毒VP3基因的质粒作为RPA扩增的靶标，随后将RPA扩增产物作为RPA–CRISPR/Cas12a检测的靶标。
图3. RPA与CRISPR/Cas12a技术整合的必要性分析
(A)以含VP3基因的质粒（浓度为10⁵ copies/μL，标记为“RPA阳性”）或无核酸酶的ddH₂O（标记为“RPA阴性”）为模板进行RPA扩增的荧光动力学曲线。RPA反应体系中加入了EvaGreen荧光染料。(B) CRISPR/Cas12a系统分别以RPA阳性扩增产物或阴性扩增产物为靶标的实时荧光动态曲线。(C) 未借助RPA扩增时，CRISPR/Cas12a体系的灵敏度检测。数据以均值±标准差（SD）表示（n=3）。统计学显著性标注如下：“***”表示p<0.001，“ns”表示p>0.05。
图4. RPA–CRISPR/Cas12a检测体系的条件优化
以不同浓度的Cas12a（A）、crRNA（B）及FQ-ssDNA荧光报告探针（C）进行实验，比较其荧光强度与信背比（S/B）。S/B定义为荧光信号与背景信号的比值。数据以平均值 ± 标准差（SD）表示（n = 3）。
图5. RPA–CRISPR/Cas12a检测体系的性能评估
图6 RPA–CRISPR/Cas12a方法用于临床样品检测
团队介绍：王 劭，研究员，中共党员，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验访问学者，福建省青年岗位能手。
主要从事水禽新发病毒性疫病分子流行病学与分子病毒学研究。承担国家与省级科研项目十余项，主持国家自然科学基金青年基金项目1项，在Journal of Clinical Microbiology等国内外学术期刊发表第一作者和通讯作者论文30多篇，成功建立水禽细小病毒实验室鉴别诊断方法，并获得国家专利授权；作为团队骨干成员之一，获省科技进步奖2项，国家一类新兽药证书 3 项，疫苗临床试验批件 2 项，福建省地方标准1项，国家发明专利以及实用新型专利十余件。
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